Para que os aminoácidos se combinem na ordem correta, é necessário proteger o grupo amino em um componente e o grupo carboxila no outro. Na maioria das vezes, os grupos benziloxicarbonila e terc-butiloxicarbonila são usados ​​para proteger os grupos amino, pois na maioria dos casos isso leva a uma diminuição da racemização nos centros vizinhos.

Os grupos ácidos são frequentemente protegidos por conversão em ésteres benzílicos. Na síntese em fase sólida, o aminoácido é ligado ao polímero como um éster benzílico substituído.

Outros grupos funcionais também podem exigir proteção. Em particular, o grupo guanidilo é nitrado e os grupos hidroxilo são convertidos em éteres benzílicos.

Os grupos benzil são removidos do produto por tratamento com ácido trifluoroacético, e os grupos nitro por hidrogenação catalítica, conforme mostrado abaixo nas etapas finais da síntese em estado sólido da bradicinina:

14.7.2.2. Reações de formação de ligação peptídica

As reações incluídas neste grupo são os processos de ligação do grupo amino de um aminoácido com o grupo carboxila de outro aminoácido para formar uma amida (ou peptídeo). As amidas são geralmente obtidas pela reação de uma amina com um cloreto de ácido, éster ou anidrido de ácido. As duas últimas variantes são as mais utilizadas, pois o uso do cloreto de ácido leva a um aumento da racemização do aminoácido.

A racemização durante a formação da ligação peptídica é devida à formação de oxazolona (70), que prontamente racemiza conforme mostrado abaixo:

A taxa de racemização depende da natureza dos grupos; pode ser um grupo protetor para grupos amino livres [neste caso, a racemização pode ser reduzida se for um ou ambos o restante da cadeia peptídica. Neste último caso, quase nada pode ser feito para alterar o grau de racemização. é o radical do aminoácido utilizado e, portanto, não pode ser modificado. X é o grupo usado para ativar o ácido, por isso muitas pesquisas foram feitas para encontrar a melhor maneira de ativar o grupo carboxila com um pequeno grau de racemização. Vamos agora considerar vários dos métodos mais comumente usados ​​para ativar o grupo carboxila.

método azida. A sequência de reações que compõe o método é dada a seguir:

A principal vantagem deste método é uma pequena racemização, mas também tem duas desvantagens significativas: em primeiro lugar, um número bastante grande de etapas; em segundo lugar, a possibilidade de rearranjo da azida (72) em isocianato (73), o que leva a uma uréia derivado (74), que é difícil de separar do peptídeo:

Este método é frequentemente usado na síntese de blocos quando não é possível ligar blocos através de fragmentos de glicina ou prolina (Seção 14.7.3),

Diciclohexilcarbodiimida Este método consiste em converter o grupo carboxila em um éster ativado tipo 75:

As vantagens deste método são as seguintes: bons rendimentos com um tempo de reação curto e um baixo grau de racemização no caso em que ou Ao mesmo tempo, existem desvantagens: em primeiro lugar, racemização se o resíduo de aminoácido; em segundo lugar, a contaminação do produto com diciclohexilureia (76), que é difícil de separar, e em terceiro lugar, a reação do éster ativado (75) com o aminoácido α-protegido para formar o anidrido (77), que também pode ser separado apenas com dificuldade do peptídeo:

A diciclohexilcarbodiimida é o agente de condensação mais comumente usado na síntese em fase sólida (Seção 14.7.2.3).

No método DHCC é possível utilizar aditivos que reduzem a racemização. Especialmente amplamente utilizados como aditivos são hidroxibenzotriazol (79), hidroxissuccinimida (78) e Eles interagem facilmente com éster ativado (75) para formar intermediários muito ativos, por exemplo, que

reagem com o aminoácido protegido antes que ocorra uma racemização significativa:

Método do éster ativado. Se o grupo carboxila pode ser facilmente convertido em um grupo éster que pode facilmente interagir com um grupo amino livre, então a formação de uma ligação peptídica ocorre sob condições suaves e com altos rendimentos. Muitos éteres foram investigados, incluindo éteres α-nitrofenílicos e tiofenílicos, mas o éter pentaclorofenílico provou ser o mais conveniente.

Os ésteres pentaclorofenílicos estão entre os mais ativos; os ésteres de aminoácidos correspondentes são caracterizados, em regra, por pontos de fusão mais altos do que outros representantes de ésteres ativados. Além disso, ao contrário dos éteres -nitrofenil e tiofenil, eles são resistentes à hidrogenação catalítica e, portanto, podem ser usados ​​nos casos em que a remoção seletiva de, por exemplo, grupos benziloxicarbonil por hidrogenação catalítica é realizada:

A racemização é particularmente baixa: acredita-se que seja o resultado de requisitos estéricos dos átomos de cloro nas posições 2 e 6, o que impede a formação de oxazolona.

Os éteres pentaclorofenílicos podem ser obtidos a partir de aminoácidos por reação com pentaclorofenol na presença de diciclohexilcarbodiimida ou por reação com pentaclorofeniltricloroacetato na presença de trietilamina:

14.7.2.3. Síntese de peptídeos em fase sólida

Um dos avanços importantes na síntese de peptídeos ocorreu em 1962, quando Merrifield descreveu pela primeira vez a síntese de um tetrapeptídeo usando o método da fase sólida, que tem sido frequentemente associado ao seu nome desde então. Este método consiste nos seguintes passos:

1. Ligação de um aminoácido protegido a um copolímero de estireno com divinilbenzeno, no qual 5% de seus grupos fenil são clorometilados (82):

Deve-se notar que - este é um éster benzílico substituído, portanto, durante esta etapa, não apenas o grupo amino é adicionado ao copolímero, mas também o grupo carboxílico é protegido.

2. Remoção do grupo protetor α (etapa A).

3. Reação de um grupo amino livre com um aminoácido protegido, na maioria das vezes como agente de condensação (com ou sem aditivos) (estágio B):

4. Repita as etapas usando aminoácidos β-protegidos até que todos os aminoácidos desejados estejam ligados.

5. Remoção do peptídeo protegido do polímero; mais frequentemente usado para isso em ácido trifluoroacético. Este reagente também remove outros grupos protetores, incluindo α-benziloxicarbonil, β-butilococarbonil e O-benzil.

6. Remoção de outros grupos protetores.

Pode não ser vantajoso sintetizar um peptídeo contendo mais de 15 unidades de aminoácidos dessa maneira, mas a ribonuclease, que consiste em 124 unidades de aminoácidos, foi sintetizada em sua totalidade usando reações em bloco de fase sólida (Seção 14.7.1).

Vantagens do método: 1) as reações ocorrem rapidamente com altos rendimentos; 2) quase nenhuma racemização ocorre (ou é muito pequena) se for terc-butila ou benziloxicarbonila, pois a reação ocorre em um aminoácido β-protegido; 3) a purificação dos compostos intermediários nada mais é do que a lavagem do polímero dos reagentes não poliméricos, se a reação for concluída; 4) o método pode ser automatizado (a síntese de nonapeptídeo pode ser realizada em cerca de

Limitações do método: 1) a adição incompleta do aminoácido C-terminal aos grupos benzílicos do polímero pode levar à formação de impurezas, por exemplo, na síntese de um pentapeptídeo, uma cadeia pode ser formada pela reação de o segundo aminoácido com o grupo benzil permanecendo no primeiro estágio. Essa reação compete com a etapa de adição incompleta do aminoácido α-protegido ao grupo amino livre (a etapa pode levar a peptídeos encurtados (por exemplo, e sequências incorretas (por exemplo, a falta de métodos analíticos para determinar impurezas) que pode ser usado sem separar o peptídeo do polímero.Tal determinação pode ser muito dispendiosa, demorada e por si só leva à quebra do produto.

14.7.3. Síntese de peptídeo de alto peso molecular - inibidor básico de tripsina (BTI) a partir de pâncreas bovino

Verificou-se que esse peptídeo, composto por 58 unidades de aminoácidos (peso molecular 6500), possui a sequência de unidades de aminoácidos mostrada na página 336.

A síntese desse peptídeo, descrita em vários artigos, ilustra a estratégia utilizada nesses casos.

O método usa pré-sintetizados

blocos, que são então conectados através de fragmentos de glicina (indicados em negrito em 84) para eliminar o problema de racemização nos estágios finais. Os peptídeos sintetizados (1-12), (13-28), 29-56) e (57-58) foram ligados entre si pelo método de fase sólida.

O grupo -metoxibenziloxi protetor de cadeia foi ligado a

copolímero bromometilado de estireno com divinilbenzeno. Cada bloco peptídico e (1-12)] foi ligado a uma cadeia peptídica crescente, enquanto a diciclohexilcarbodiimida (DCHA com a adição de N-hidroxissuccinimida (HSI) foi usada como agente de condensação. O peptídeo ativo foi separado do polímero, o protetor grupos foram removidos por ação.Tudo isso pode ser escrito como um diagrama (ver página 336; TFA - ácido trifluoroacético).

O rendimento global do produto 85 foi de cerca de 40%, dos quais apenas 10% do ativo 84 purificado pode ser obtido.

Os blocos foram sintetizados por fragmentos de ligação obtidos por síntese linear ou convergente. Ao construir o bloco (1-12), a ligação dos fragmentos foi realizada por links de prolina, pois a racemização é mínima neste caso. Na maioria dos casos, o acoplamento foi realizado pelo método do éter ativado usando éteres pentaclorofenil (PCP) ou -nitrofenílico. O esquema para a síntese do bloco protegido por β-benziloxicarbonilo é mostrado abaixo.

Nos casos em que as unidades de prolina não podem ser utilizadas como sítio de ligação dos fragmentos, sua ligação é realizada pelo método da azida, em que a racemização é menor.

A atividade global do produto (80%) é maior do que no caso da síntese gradual de acordo com Merrifield (30%).

Ministério da Educação e Ciência da Federação Russa

Instituição Educacional Autônoma do Estado Federal de Educação Profissional Superior "Universidade Federal dos Urais nomeada em homenagem ao primeiro presidente da Rússia B.N. Yeltsin"

Departamento de Tecnologia de Síntese Orgânica

Resumo sobre o tema: “Princípios e métodos de síntese em fase sólida. Síntese de peptídeos »

Realizado pelo aluno gr. Х-300803

Shaikhutdinova A.I.

Verificado por Berseneva V.S.

Ecaterimburgo 2013

1. Introdução………………………………………………………………………3

2. O que são peptídeos? ....................................... ...................................................4

2.1. A estrutura dos peptídeos……………………………………………………….5

2.2. Síntese de peptídeos………………………………………………………….7

3. Síntese de peptídeos em fase sólida……………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………

3.1. Método Merrinfield………………………………………………………10

3.2. Substrato sólido…………………………………………………….14

3.3. Seleção de substrato……………………………………………………...14

3.4. Ligadores……………………………………………………………….16

4. A primeira síntese de um hormônio natural - oxitocina……………………….22

5. Síntese de insulina na célula……………………………………………………..30

6. Conclusão………………………………………………………………..34

7. Literatura…………………………………………………………………...35

Introdução

Em química orgânica, não há uma única reação que, na prática, forneça rendimentos quantitativos de produtos alvo em qualquer caso. A única exceção parece ser a combustão completa de substâncias orgânicas em oxigênio em alta temperatura para CO 2 e H 2 O. Portanto, a purificação do produto alvo é uma tarefa complexa e demorada. Por exemplo, a purificação de 100% dos produtos da síntese de peptídeos é um problema intratável. De fato, a primeira síntese completa de um peptídeo, o hormônio oxitocina (1953), contendo apenas 8 resíduos de aminoácidos, foi considerada uma conquista notável que rendeu ao seu autor, V. du Vignot, o Prêmio Nobel em 1955. No entanto, no próximo vinte anos, a síntese de polipeptídeos dessa complexidade virou rotina, de modo que atualmente a síntese de polipeptídeos compostos por 100 ou mais resíduos de aminoácidos não é mais considerada uma tarefa intransponível.

O objetivo do trabalho: desmontar e explicar: "O que causou mudanças tão dramáticas no campo da síntese de polipeptídeos?"

O que são peptídeos?

Peptídeos são compostos naturais ou sintéticosmoléculasque são construídos a partir dos restosalfa-aminoácidos interligados por ligações peptídicas (amida) C (O) NH. Pode conter emmoléculatambém um componente não aminoácido (por exemplo, um resíduocarboidrato). De acordo com o número de resíduos de aminoácidos emmoléculas peptídeos, distinguir entre dipeptídeos, tripeptídeos, tetrapeptídeos, etc. Peptídeos contendo até 10 resíduos de aminoácidos são chamados de oligopeptídeos, aqueles contendo mais de 10 resíduos de aminoácidos são chamados de polipeptídeos. polipeptídeoscom um peso molecular de mais de 6 mil são chamadosproteínas.

Pela primeira vez, peptídeos foram isolados de hidrolisados ​​de proteínas enzimáticas. O termo "peptídeos" foi proposto por E. Fisher. O primeiro peptídeo sintético foi obtido por T. Curtius em 1881. E. Fisher em 1905 desenvolveu o primeiro método geral para a síntese de peptídeos e sintetizou vários oligopeptídeos de várias estruturas. A contribuição atual para o desenvolvimento da química dos peptídeos foi feita pelos alunos de E. Fischer, E. Abdergalden, G. Leike e M. Bergman. Em 1932, Bergman e L. Zervas usaram o grupo benziloxicarbonila (grupo carbobenoxi) na síntese de peptídeos para proteger os grupos alfa-amino de aminoácidos, o que marcou uma nova etapa no desenvolvimento da síntese de peptídeos. Os aminoácidos N-protegidos obtidos (N-carbobenoxiaminoácidos) foram amplamente utilizados para obter vários peptídeos, que foram usados ​​com sucesso para estudar uma série de problemas-chave na química e bioquímica dessas substâncias, por exemplo, para estudar a especificidade do substrato de enzimas proteolíticas. Com o uso de N-carbobenoxiaminoácidos, peptídeos naturais (glutationa, carnosina, etc.) foram sintetizados pela primeira vez. Uma conquista importante nesta área foi desenvolvida no início dos anos 50. P. Vaughan e outros Síntese de peptídeos pelo método de anidrido misto.

Em 1953, V. Du Vigno sintetizou o primeiro hormônio peptídico, a ocitocina. Com base no conceito de síntese de peptídeos em fase sólida desenvolvido por P. Merrifield em 1963, foram criados sintetizadores automáticos de peptídeos. Métodos para síntese enzimática controlada de peptídeos têm sido intensamente desenvolvidos. O uso de novos métodos tornou possível sintetizar o hormônio insulina, etc.

Avanços na química sintética de peptídeos foram preparados por avanços no desenvolvimento de tais métodos para a separação, purificação e análise de peptídeos como cromatografia de troca iônica, eletroforese em vários meios, filtração em gel, cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), análise imunoquímica , etc. métodos de análise de grupo final e métodos de clivagem passo a passo de peptídeos. Em particular, foram criados analisadores automáticos de aminoácidos e dispositivos automáticos para determinar a estrutura primária de peptídeos, os chamados sequenciadores.

Uso: na química de peptídeos na síntese de cadeias peptídicas contendo histidina e serina. A essência da invenção: um método para síntese em fase sólida de peptídeos do f-ly 1 geral, incluindo a ligação de aminoácidos terminais N-protegidos a um transportador sólido inerte, a subsequente adição de aminoácidos N-protegidos ao cadeia peptídica crescente, e a cadeia lateral do resíduo de serina é temporariamente protegida por um grupo que é lábil em relação aos agentes usados ​​para remover grupos protetores de alfa-amino, e a cadeia lateral de histidina, se presente, é protegida com um grupo que é lábil a um agente de desbloqueio alfa-amino; remoção ao final de cada ciclo do grupo protetor, clivagem do polipeptídeo do carreador por aminólise ou amonólise, isolamento do composto resultante I. F-la I: R 1 -R 2 -R 3 -Ser-Tyr-R 4 -heu-R 5 -Pro -R 6 onde R 1 é piro-Glu, N-AcDNal; R 2 His, DpClPhe, DpFPho, R 3 = Tgr, D-Tgr; R 4 \u003d DNal (2), Dh Arg (Et) 2 Dh Arg (Bu), Dh Arg (CH 2 CF 3) 2 R 5 \u003d Agd, L-Arg (Et) 2 L-hArg (Bu), L- hArg(CH 2 CF 3) 2 R 6 GlyNH 2 DAla NH 2

A invenção refere-se à síntese em fase sólida de um análogo do hormônio liberador do hormônio luteinizante (hormônio liberador de LH) por um método de proteção mínima. Os análogos do hormônio liberador de LH (doravante referidos como LH-RH) são nona- ou decapeptídeos que estão estruturalmente relacionados ao LH-RH e exibem atividade biológica semelhante à do LH-RH. Os análogos são objeto de extensa pesquisa clínica devido à sua capacidade comprovada de aliviar os sintomas da endometriose, câncer de próstata, puberdade precoce e outras doenças mediadas por hormônios. Embora certos análogos de LH-RH sejam atualmente adequados para uso terapêutico, sua síntese é um processo complexo e, consequentemente, um método caro para sua preparação aumenta o custo dos análogos, tão necessários para o tratamento. Os análogos de LH-RH são tradicionalmente descritos como agonistas ou antagonistas, dependendo de seu modo de ação. Os análogos de LH-RH de acordo com a invenção são nona- e decapéptidos e incluem agonistas e antagonistas. Exemplos de agonistas de LH-RH úteis na presente invenção são nafarelina, leuprorrelina, buserelina, goserelina, histerrelina, triptorrelina e deslorelina, que diferem do LH-RH de ocorrência natural pela substituição do resíduo de glicina na posição 6 por um D-amino ácido. Os agonistas sintéticos têm, em conjunto com o hormônio de ocorrência natural, uma histidina na posição 2, uma serina na posição 4 e uma tirosina na posição 5, todas com cadeias laterais reativas que podem se tornar dificuldades sintéticas. Os antagonistas de LH-RH diferem do LH-RH de ocorrência natural tipicamente pela deleção ou substituição do resíduo de histicidina na posição 2. De uma perspectiva sintética, a deleção de histidina reduz a probabilidade de reações colaterais indesejadas, no entanto, a presença de serina e tirosina ainda requer cuidado especial para eliminar a ocorrência de reações em cadeia lateral. Os análogos de LH-RG podem ser sintetizados por vários métodos, tais como os descritos por JM Stewart e JD Young, Solid Phase Peptide Synthesis, Wu. H. Freeman Co. São Francisco, 1969; J. Meinenhofer, Hormonal Proteins and Peptides, Volume 2, página 46, Academic Press (Nova York), 1973; e E. Schroeder e K. Lübke, Peptides, Volume l, Academic Press (New York), 1965. Os métodos podem ser amplamente caracterizados como métodos de fase de solução ou de fase sólida. Ambos os métodos envolvem a adição sequencial de aminoácidos à cadeia crescente de peptídeos. Normalmente, o grupo amino ou carboxila do primeiro aminoácido é protegido por um grupo de proteção adequado. O aminoácido protegido pode então ser ligado a um suporte sólido inerte ou usado em solução adicionando o próximo aminoácido protegido em sequência sob condições adequadas para a formação de ligação amida. O grupo protetor é então removido deste resíduo de aminoácido recém-adicionado, seguido pela adição do próximo aminoácido e assim por diante. Uma vez que todos os aminoácidos necessários tenham sido anexados na sequência correta, quaisquer grupos protetores remanescentes e qualquer suporte sólido são removidos para obter o polipeptídeo final. Por uma simples modificação deste procedimento geral, mais de um aminoácido pode ser adicionado de uma só vez à cadeia crescente, por exemplo, acoplando um tripéptido protegido a um dipéptido protegido, o que resulta num pentapéptido. Condições mais rigorosas para a síntese em fase sólida geralmente requerem que quaisquer cadeias laterais reativas nos aminoácidos sejam protegidas durante a formação da ligação amida. Os grupos protectores da cadeia lateral são geralmente clivados num passo separado após, ou em conjunto com, a clivagem do polipéptido resultante do transportador inerte. Um método de síntese em fase sólida particularmente útil para a preparação de análogos de LH-RG é descrito na Patente US No. 4.234.571 de Nestor et al., cuja descrição é aqui incorporada como referência. Nesta abordagem geral, a função α-amino (N) de cada aminoácido é protegida por um grupo sensível a ácido ou base, como terc-butiloxicarbonil (Boc); quaisquer cadeias laterais reativas, como as presentes na serina, histidina e tirosina, também são protegidas por grupos altamente ligados que requerem tratamento com fluoreto de hidrogênio (HF) ou técnicas radicais semelhantes para clivá-los. Além disso, a clivagem dos grupos protetores de α-amino e dos grupos protetores da cadeia lateral é geralmente realizada em uma etapa separada. Esta abordagem é suficiente para obter quantidades de pesquisa de peptídeos, no entanto, esses métodos são insuficientes para a produção em larga escala de peptídeos. Os aminoácidos com cadeias laterais totalmente protegidas são caros e esses custos podem ser um fator significativo na produção comercial de peptídeos. Além disso, o uso de fluoreto de hidrogênio, para não mencionar o envenenamento ambiental, leva a perdas comercialmente inaceitáveis ​​no rendimento do produto. Mais importante, devido ao uso de uma etapa de fabricação separada para clivar os grupos protetores da cadeia lateral, o processo sintético requer tempo e custo adicionais. As formas alternativas não são mais atraentes. Tien e outros Pept. Chem. 375-379, T, Shiba e S. Sakakibara (Eds.), Protein Research Organization, Osaka (1088), delineou a síntese de LH-RH usando proteção tosil contra histidina e proteção benzil contra tirosina e serina. Esta abordagem, embora elimine a necessidade de fluoreto de hidrogênio, ainda requer uma etapa separada de desidrogenação para remover os grupos protetores de benzila; neste caso, ocorre alguma recuperação do triptofano. Coy D. H. etc. I. Peptide Protein Res. 14, 339-343 (1979), relatam a síntese de antagonistas de LH-RH, (D-Phe 2 , D-Trp 3 , D-Jhe 6 ) LH-RH, usando uma variedade de métodos de proteção de cadeia lateral, todos os quais envolvem liberação de HF da proteção; resultando em proteção de cadeia lateral de benzila somente serina, proteção de cadeia lateral de tosil somente de arginina, proteção de cadeia lateral de serina e arginina e proteção de cadeia lateral de serina, arginina e tirosina (com 2-bromobenziloxicarbonil). A proteção de sal da arginina (como Arg HCl) também é usada na síntese "somente serina". O fluoreto de hidrogênio é usado para separar o peptídeo bruto de seu transportador, bem como para separar os grupos protetores da cadeia lateral. Somente quando o peptídeo é "totalmente" desprotegido (e apenas proteção de sal contra arginina), apenas os autores de patentes podem evitar o tratamento com flúor. Todos os tipos de síntese protegida levam a resultados ruins em comparação com a síntese com uma cadeia lateral desprotegida. Coy et al. relatam ainda a síntese de um agonista de LH-RH: etilamida (D-Leu 6 , des Gly-NH 2 10)-LH-RH, usando proteção de cadeia lateral com dinitrofenil em relação a histidina sozinha, proteção de sal de arginina, mas sem tratamento para IC. O grupo protector dinitrofenilo da cadeia lateral é clivado durante a clivagem do péptido do seu veículo com uma solução de etilamina em dimetilformamida. O rendimento da síntese com apenas proteção de histidina é de apenas 34% em comparação com o rendimento da síntese com proteção total e tratamento com HF. Sem comparação com a síntese desprotegida. A técnica conhecida sugere que, entre várias estratégias de proteção mínima, a proteção apenas com histidina pode resultar em rendimentos mais altos do que a síntese de proteção total para alguns antagonistas de LH-RH, no entanto, nenhum benefício definitivo pode ser derivado de considerar essas abordagens de proteção de cadeia lateral. contra LH-RH agonistas. Embora a abordagem ideal para eliminar a etapa de desproteção do HF possa ser adotada para uma síntese desprotegida, a falta de proteção para a histidina resulta em racemização excessiva. De acordo com a doutrina de Coy et al., no entanto, o Requerente descobriu que o uso de proteção apenas com histidina também resulta em altos níveis de impureza bis-serina devido à acilação do resíduo serina. Para alcançar uma síntese minimamente protegida de análogos de LH-RH sem uma etapa de desproteção, é necessária uma melhoria significativa em relação à técnica anterior, que também pode fornecer proteção para aqueles grupos que, quando desprotegidos, têm um efeito negativo na pureza e no rendimento. . O objetivo da invenção é fornecer um método para a síntese de análogos de LH-RG, no qual as cadeias laterais de apenas um número mínimo de resíduos de aminoácidos são protegidas. É outro objetivo da invenção fornecer um processo para a síntese de análogos de LH-RH que elimine a necessidade de desproteção de HF, bem como a necessidade do uso de um reagente de HF tóxico, reduzindo o fluxo de resíduos tóxicos frequentemente encontrados em processos. Os referidos aspectos da invenção fornecem os benefícios adicionais de reduzir o custo de preparação de compostos lH-RH, bem como eliminar a etapa adicional de desproteção da cadeia lateral. Os objetivos da invenção são alcançados em relação aos análogos de LH-RH usando um método de proteção mínima temporária em que apenas a cadeia lateral hidroxila do resíduo de aminoácido é protegida por um grupo que é clivado imediatamente após a ligação da serina à cadeia peptídica . O grupo protetor da cadeia lateral é um grupo que é lábil sob as mesmas condições que são adequadas para a clivagem de grupos protetores de α-amino. Para os análogos de LH-RH que contêm um resíduo de histidina, a cadeia lateral do imidazol também pode ser protegida com um grupo lábil durante o ciclo de acoplamento, preferencialmente lábil ao agente desbloqueador do grupo α-amino, porém, opcionalmente, pode ser protegida com um grupo clivado por aminosil ou amonólise. A proteção temporária da cadeia lateral da serina e a proteção da cadeia lateral da histidina, quando disponíveis, minimizam a formação de impurezas e maximizam o rendimento do produto sem a necessidade de uma etapa de desproteção de HF. O método de proteção mínima temporária da invenção é adequado para a síntese em fase sólida de qualquer polipeptídeo contendo serina com poucos a muitos resíduos, independentemente do resto da sequência. Os análogos de LH-RH, assim como outros nona e decapeptídeos, são alvos sintéticos preferidos. Embora a invenção tenha sido descrita em termos de adição sequencial de aminoácidos individuais, um especialista na técnica apreciará que um método é igualmente aplicável à síntese em que blocos de polipeptídeos menores são ligados para formar polipeptídeos maiores, por exemplo, adicionando um tetrapeptídeo a um pentapeptídeo, desde que a cadeia lateral dos resíduos de serina seja temporariamente protegida durante o ciclo de ligação da serina. A proteção temporária significa que a cadeia lateral da serina é protegida por um período relativamente curto do ciclo sintético. O grupo protector da cadeia lateral e os grupos protectores α-amino e carboxilo são cortados simultaneamente após a ligação da serina ter ocorrido. Via de regra, o critério decisivo para a seleção do grupo protetor da cadeia lateral da serina é o fato do grupo ser resistente às condições de ligação, mas lábil às condições de desproteção do grupo α-amino. Em uma modalidade da presente invenção usando proteção de α-amino, a cadeia lateral de serina é preferencialmente protegida com um grupo selecionado de t-butil, t-butildimetilsilil, trimetilsilil, tritil, pivalil e tetra-hidropiran-2-il. Para os análogos de LH-RH que possuem resíduos de histidina, é geralmente desejável proteger a cadeia lateral do imidazol. Essa proteção também pode ser transitória, isto é, instável durante o ciclo de ligação, ou pode permanecer até que o peptídeo seja separado de seu transportador. De preferência, a aminólise ou amonólise é utilizada para separar o polímero do seu veículo e simultaneamente separar o grupo protector da histidina. Em outra modalidade da invenção, o agente de desbloqueio é selecionado a partir de soluções de cloreto de hidrogênio em C 3 -C 6 álcoois e diclorometano. De preferência, a proporção de álcool para diclorometano é de 0,1 a 10,0 (v/v) e a concentração de ácido é de 2 a 9N. Mais preferencialmente, o álcool é isopropanol. Abreviaturas e definições Para os fins da invenção, "LH-RH" refere-se ao hormônio liberado pelo hormônio luteinizante e "análogos de LH-RH" refere-se ao próprio LH-RH, bem como a outros polipeptídeos estruturalmente relacionados ou derivados de LH-RH, e que exibem atividade biológica semelhante à do LH-RG. Abreviaturas para vários aminoácidos tradicionais são recomendadas pela Comissão de Nomenclatura Bioquímica da União Internacional de Química Pura e Aplicada da União Bioquímica Internacional (IUPAC-MBS), Biochemistry, 11, 1726 (1972). Todas as sequências peptídicas mencionadas aqui são escritas de acordo com a convenção comum em que o aminoácido N-terminal está à esquerda e o aminoácido C-terminal está à direita. As abreviaturas dadas aqui representam L-aminoácidos, com exceção do aminoácido aquiral glicina, e com a outra exceção de qualquer aminoácido não natural que seja aquiral, ou aminoácidos são designados como D- ou D, L-. Et é etil. Bu é butil e iPr é isopropil. Outras abreviaturas úteis na descrição da invenção incluem substituições de aminoácidos no peptídeo LH-RG natural com os seguintes resíduos de aminoácidos: -(p-clorofenil)alanil р-Cl-Phe 3-(3-piridil)alanil Pal (3) N G ,N G" -bis(etil)homo-arginil hArg (Et) 2 N G ,N G" -bis(2,2,2-trifluoroetil)homo-arginil hArg (CH 2 CF 3) 2 N G -butil-homoarginil hArg (Bu ) N E -Isopropil-lisil Lys (iPr) (benzil) histidil His (Bzl) O termo "sais farmaceuticamente aceitáveis" refere-se a sais que retêm a atividade biológica desejada do composto relacionado sem efeitos toxicológicos adversos. Exemplos de tais sais são sais de adição de ácido formados com ácidos inorgânicos, tais como ácido clorídrico, ácido bromídrico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico, ácido nítrico e assim por diante; e sais formados com ácidos orgânicos como, por exemplo, ácido acético, ácido oxálico, ácido tartárico, ácido succínico, ácido maleico, ácido fumárico, ácido glucônico, ácido cítrico, ácido málico, ácido ascórbico, ácido algínico, ácido poliglutâmico, ácido naftalenosulfônico , ácido naftalenodisulfônico, ácido poligalacturônico e assim por diante. A abreviatura "N-Ac" refere-se especificamente a um grupo protetor de N-acetil, ou seja, um grupo acetil ligado a um resíduo de aminoácido terminal em um nitrogênio amino, de acordo com a nomenclatura comum. Modalidades preferidas Em uma modalidade, a invenção fornece um método de proteção mínima aprimorado para síntese em fase sólida de um composto possuindo uma sequência de aminoácidos da fórmula: R 1 -R 2 -R 3 -Ser-Tyr-R 4 -Leu-R 5 -Rro-R 6 (1) onde R 1 é selecionado de (piro) Glu e N-Ac-D-Nal (2); R2 é selecionado de His. D-p-Cl-Phe e D-p-F-Phe; R 3 é selecionado de Trp. D-trp. R 4 é selecionado de D-Nal- (2), D-hArg (Et) 2 . D-hArg (Bu), D-hArg (CH 2 CF 3) 2 . R 5 é selecionado de Arg, L-hArg (Et) 2 , D-hArg (Bu), D-hArg- (CH 2 CF 3) 2 . R 6 é selecionado de Cly-NH 2 , D-Ala-NH 2 , em que os aminoácidos são fornecidos com N-proteção, caracterizados por realizarem (a) proteção temporária da cadeia lateral de serina na posição 4, adequadamente, com um grupo lábil para aqueles agentes que são adequados para clivagem de grupos protetores de α-amino sem causar racemização, reações colaterais ou clivagem do peptídeo nascente de seu transportador polimérico e (b) proteger a cadeia lateral de histidina, se presente, com um grupo lábil a um agente desbloqueador de α-amino ou a aminólise ou amonólise. Em outra modalidade, a invenção fornece um método de proteção mínima temporária para a síntese em fase sólida de um composto de fórmula (l), em que (a) protege os grupos α-amino dos aminoácidos no polipeptídeo, (b) protege a serina cadeia lateral com um grupo lábil para os agentes adequados para clivagens com um grupo protetor α-amino, (c) proteger a cadeia lateral de histidina, se presente, com um grupo lábil para agentes desbloqueadores básicos ou um grupo clivado por aminólise ou amonólise, (d) amarrar o aminoácido C-terminal a um suporte sólido inerte, (e) ligar sequencialmente, com a ajuda de um aglutinante adequado, um ou mais aminoácidos selecionados entre si em ciclos sucessivos, começando do C-terminal , (f) clivar, no final de cada ciclo, os grupos protetores por tratamento com um agente de desbloqueio, e o referido agente de desbloqueio é selecionado a partir de agentes, capaz de clivar tanto o grupo protetor de α-amino quanto o grupo protetor de cadeia lateral sem racemização, reações colaterais ou clivagem do peptídeo nascente do polímero, (g) repetir as etapas de acoplamento e clivagem para formar um nona- e decapeptídeo, (h) clivar o polipeptídeo do transportador por aminólise ou amonólise; e (i ) isolando e purificando o polipeptídeo resultante. Em outra modalidade, a invenção fornece um método para a síntese em fase sólida de um composto de fórmula I, em que (a) a síntese em fase sólida acopla a correspondente serina protegida por Boc e protegida por t-butil em ciclos sucessivos e da direita para a esquerda ordem relativa à sequência de aminoácidos do composto de fórmula I, começando com Boc -R6-O- ligado covalentemente a um suporte sólido inerte, (b) clivando, no início de cada ciclo, o grupo protetor Boc e simultaneamente o grupo terc-butila de serina ou D-serina por tratamento com um agente de desbloqueio selecionado de HCl/CH 2 Cl 2 HCl (alcanoil inferior) CH 2 Cl 2 , para formar uma ligação polipeptídica com o referido suporte sólido, (c) clivar o polipeptídeo do suporte por amonólise, e (d) isolar o polipeptídeo resultante. Numa concretização preferida, a invenção proporciona o método descrito acima para obter um polipéptido possuindo a fórmula acima, onde R 1 denota (piro) Glu ou N-Ac-D-Nal (2); R2 é His ou D-p-Cl-Phe; R3 é Trp; R 4 é D-Nal (2), D-hArg (Et) 2 ; R 5 é Arg ou L-hArg (Et) 2 e R 6 é Gly-NH 2 ou D-Ala-NH 2 . Numa concretização preferida do invento, a função dos aminoácidos -amino (N) é protegida por um grupo sensível a ácido ou base. O grupo protetor é resistente às condições de formação da ligação peptídica, embora seja facilmente removido sem destruir a cadeia peptídica crescente ou racemizar qualquer um dos centros quirais que contém. Grupos de proteção adequados são t-butoxicarbonil (Boc), bifenilisopropiloxicarbonil, t-amiloxicarbonil, isoborniloxicarbonil, α-dimetil, 3,5-dimetoxibenziloxicarbonil, o-nitrofenilsulfenil, 2-ciano-t-butiloxicarbonil, 9-fluoroenilmetiloxicarbonil (Fmoc) e assim por diante . De preferência, o grupo protector de α-amino é t-butoxicarbonilo (Boc). Quando se deseja preparar um peptídeo como buserelina ou goserelina em que R 4 na Fórmula (1) acima é D-Ser (tert-Bu), Fmoc é preferido para proteção de N em ciclos de acoplamento incluindo e seguindo a adição de D -Ser (tBu). Fmoc também é lábil a reagentes básicos (pH 8,5) como a piperidina que não cliva tBu de D-Ser (tBu). Nos últimos ciclos após a adição de D-Ser (tBu), deve-se usar uma proteção N-sensível à base. A cadeia lateral da serina na posição 4 é protegida por um grupo que pode ser removido, por exemplo, por tratamento suave com flúor. Um grupo protector de cadeia lateral de serina preferido é o t-butildimetilsililo. A cadeia lateral hidroxila do resíduo de serina é protegida durante a ligação da serina ao peptídeo nascente conforme descrito para a modalidade geral da presente invenção. O grupo protetor da cadeia lateral é removido após a ligação e antes da adição do próximo aminoácido. O grupo protetor da cadeia lateral da serina é clivado com o mesmo reagente usado para clivar o grupo N-protetor. Grupos protetores de cadeia lateral de serina preferidos são t-butil, t-butildimetilsilil, trimetilsilil, tritil, pivalil e tetra-hidropiran-2-il. Além disso, a cadeia lateral imidazólica da histidina, normalmente presente nos agonistas de LH-RH, também é protegida. O grupo protector da cadeia lateral histidina pode também ser lábil durante o ciclo de acoplamento, por exemplo lábil a um agente bloqueador de N, no entanto, opcionalmente, a sua clivagem pode ser efectuada quando o péptido é separado do seu transportador. Grupos protetores de cadeia lateral preferidos para histidina são p-toluenossulfonil e 2,4-dinitrofenil. Para iniciar a síntese, o primeiro aminoácido, que é tipicamente o aminoácido C-terminal no produto final, é ligado a um suporte sólido adequado. Veículos sólidos adequados na síntese acima são aqueles materiais que são inertes aos reagentes e condições de reação das reações de desbloqueio de condensação em etapas e também insolúveis no meio usado. Exemplos de polímeros comercialmente aceitáveis ​​são polímeros de estireno/divinilbenzeno modificados com um grupo reativo, tal como copolímero de estireno-divinilbenzeno clorometilado, copolímero de estireno/divinilbenzeno hidroximetilado e assim por diante. O polímero Merrifield (1% de copolímero de estireno-divinilbenzeno clorometilado reticulado) é o preferido. A ligação a um polímero, por exemplo, um polímero de estireno-divinilbenzeno clorometilado, é realizada usando a interação do aminoácido C-terminal N-protegido, especialmente o aminoácido N-Boc, na forma de seu césio, tetrametilamônio, trietilamônio , 1,5-diazabiciclo (5.4.0) undec-5-eno ou sal semelhante em etanol, acetonitrila, N,N-dimetilformamida (DMF) e assim por diante, especialmente sal de césio em DMF, com polímero clorometilado em temperatura elevada, para por exemplo, cerca de 40-60 C, preferencialmente, cerca de 50 C, por um período de tempo de cerca de 12-72 horas, preferencialmente cerca de 48 horas. O acoplamento de aminoácidos protegidos subsequentes é realizado por métodos bem conhecidos, geralmente em um sintetizador automatizado de peptídeos. Cada aminoácido protegido é introduzido em excesso molar de aproximadamente 1,5-2,5 vezes e o acoplamento é realizado em um solvente polar inerte, não aquoso, tal como diclorometano, DMF ou suas misturas, preferencialmente diclorometano, próximo à temperatura ambiente. O agente de acoplamento é selecionado a partir de N,N"-diciclohexilcarbodiimida (DCC), N,N"-di-iso-propilcarbodiimida (DIC) ou outra carbodiimida, isoladamente ou na presença de 1-hidroxibenzotriazol (HBt), O-acilureias , benzotriazol --il-hidroxi-tris(pirrolidinofosfônio) hexafluorofosfato (PyBop), N-hidroxissuccinimida, outras N-hidroxiimidas ou oximas. Alternativamente, podem ser usados ​​ésteres de aminoácidos protegidos ativos (por exemplo, p-nitrofenil, pentafluorofenil e semelhantes) ou anidridos simétricos. O polímero de peptídeo é testado para ligação completa usando o Teste de Kaiser (Anal. Bioquim. 34, 595 (1970) excepto que no caso de ligação à prolina, é utilizado o Teste de Cloranil (Anal. Biochem. 117, 145 (1981)) ou o Teste de Isatina (Anal. Chim. 118, 149 (1980)). Se o(s) teste(s) de integridade indicar(em) que a reação não está completa, o acoplamento é repetido usando o aminoácido adicional, porém, omitindo o desbloqueio do ácido adicional. Terminada a última ligação, o polímero é lavado com metanol ou metanol contendo diclorometano e seco a uma temperatura máxima de 60°C. Quando a serina é adicionada, o agente de desbloqueio remove tanto o grupo protetor N-Boc quanto o grupo protetor serina. Entre os agentes desbloqueadores preferidos, destacam-se o cloreto de hidrogénio em diclorometano (HCl/-CH 2 Cl 2 ), o ácido trifluoroacético em diclorometano (TFA/CH 2 Cl 2 ) e o cloreto de hidrogénio dissolvido em álcool C 3 -C 6 , preferencialmente isopropanol, misturado com diclorometano. como regra, a concentração de HCl é de 2 N. até 9 n. de preferência a partir de 4 n. até 5 n. A proporção de CH 2 Cl 2 para C 3 -C 6 -álcool é 0,1-10 (vol.); preferencialmente cerca de 1:1. Um agente de desbloqueio particularmente preferido é 4,5N. Solução de HCl em i-PrOH: CH 2 Cl 2 (1:1). A etapa de desbloqueio ocorre tipicamente em temperaturas de 0 a 45°C, preferencialmente em temperatura ambiente (20 a 27°C). Um versado na técnica apreciará que a seleção de um protocolo de ligação/desbloqueio usando agentes diferentes dos descritos acima é correta, desde que o resíduo de serina seja desprotegido com um agente que atenda aos objetivos da invenção. Você pode usar a técnica usando HCl/iPrOH/CH 2 Cl 2 para cada ciclo de liberação da proteção. Alternativamente, também é aceitável um método misto no qual TFA/CH 2 Cl 2 é usado para certos ciclos e HCl/iPrOH/CH 2 Cl 2 para outros. Outros ciclos ficarão claros para o especialista. No final da síntese em fase sólida, o polipeptídeo é separado do polímero transportador. A clivagem é realizada por amonólise com uma solução saturada de amônia em um solvente adequado para peptídeos C-terminais de alanina ou glicina; para péptidos possuindo o terminal C da prolina, a clivagem é efectuada por aminólise com uma alquilamina ou um fluoroalquilamino. A clivagem é realizada a uma temperatura de cerca de 10 a 50°C, preferencialmente cerca de 25°C, por um período de cerca de 12-24 horas, preferencialmente cerca de 18 horas. Solventes adequados incluem metanol, etanol, isopropanol, dimetilformamida, tetra-hidrofurano, N,N-dimetiletanolamina, hexanos e suas misturas. De preferência, é utilizada uma solução saturada de amoníaco em metanol. Alternativamente, o peptídeo pode ser separado do polímero por transesterificação de base seguida de aminólise. O polipeptídeo é então purificado usando uma sequência de etapas cromatográficas usando qualquer um ou todos os seguintes tipos: cromatografia de troca iônica em uma resina ligeiramente básica na forma de acetato; cromatografia de absorção hidrofóbica ou cromatografia de poliestireno-divinil-benzeno não derivatizado (por exemplo, Amberlite XAD); cromatografia de absorção em sílica gel; cromatografia de troca iônica em carboximetilcelulose; cromatografia de partição (por exemplo, em Sephadex G-25) ou distribuição em contracorrente; cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), especialmente HPLC de fase reversa em uma coluna de octil ou octadecilsilil sílica. Se um aminoácido racêmico for usado em uma ou mais posições 1, 2, 3 ou 6 e produtos isoméricos individuais forem de interesse, os produtos finais diastereomericos nonapeptídeo ou decapeptídeo são resolvidos após o que o polipeptídeo desejado contendo o D-aminoácido no posição apropriada é isolada e purificada, preferencialmente, durante a implementação da técnica cromatográfica acima. O polipeptídeo isolado e purificado é opcionalmente convertido em um sal farmaceuticamente aceitável. Os exemplos a seguir comparam o método de proteção temporária da presente invenção com o método desprotegido tanto para um agonista de LH-CRH quanto para um antagonista de LH-RH. Estes exemplos são apresentados apenas para fins de especificidade e não se destinam a limitar o escopo da invenção reivindicada. Ambos os produtos dos Exemplos 1 e 3 usando o processo de proteção mínima da invenção continham significativamente menos impurezas em comparação com os produtos obtidos nos Exemplos 2 e 4 usando a síntese não protegida. Além de menos impurezas, o processo da presente invenção tem o benefício adicional de maiores rendimentos de produto e uso de reagentes menos perigosos, em um período de tempo mais curto e com menos energia para isolar e purificar os análogos de LH-RH. Um benefício adicional é a produção de quantidades menores de um fluxo de resíduos muito menos tóxico. Preparação A. Preparação de Boc-Gly-O-Polymer. 4,9 g de N-Boc-glicina são dissolvidos em uma mistura de 50 ml de metanol e 50 ml de água destilada. O pH da solução é ajustado para 7,5 com bicarbonato de césio aquoso. O solvente é então removido in vacuo. Após 18 horas de secagem sob alto vácuo, o resíduo é retomado em 150 ml de DMF seco. Adicionar 25 g em 1% de polímero de poliestireno clorometilado/divinilbenzeno (Merrifield) (correspondente a 25 mmol de cloreto). A mistura é agitada a 50°C por 24 horas, filtrada e o polímero lavado sucessivamente com DMF, água e etanol. O polímero foi seco in vacuo durante 3 dias para dar 28,34 g de Boc-Gly-O-Polymer. Preparação B. Preparação de Boc-Ala-O-Polymer. De acordo com o método de Obtenção de N-Boc-D-alanina é adicionada a 1% de polímero Merrifield para obter N-Boc-D-Ala-O-Polímero. EXEMPLO 1 Síntese de nafarelina usando proteção serina mínima. Neste exemplo, a nafarelina é preparada usando o seguinte método de proteção de cadeia lateral: proteção salina contra arginina (como cloreto), proteção tosil contra histidina e proteção terc-butila contra serina. N-Boc-aminoácidos são obtidos de Bacham, Thorens, Califórnia (Leu, Tyr, His (Tos), Arg, Trp e Gly). Star Biochemical (Torrance, CA) (Pro e Ser (tBu), Swinte Tech (Albany, OR), (D-Nal (2). Soluções de HCl 4,0-4,5 N em i-PrOH/CH 2 Cl 2 (1/1 ) é preparado borbulhando HCl em i-PrOH frio Após a saturação da solução (determinada por titulação: aprox. 9 N), é mantida à temperatura ambiente por não mais de 3 dias e diluída com igual volume de CH 2 Cl 2 antes do uso. mmol de N-Boc-Gly-O-polímero da Preparação A é colocado em um reator de sintetizador de peptídeo de fase sólida automatizado Veka 296 de 5,0 L equipado com tubos e frascos auxiliares para adicionar reagentes e para pressurizar, despressurizar e manter um nitrogênio inerte atmosfera. Os seguintes aminoácidos são adicionados ao polímero N-Boc-Gly-O por ligação assistida por DIC ou HBt DIC por 3 horas: N-Boc-Pro (2,0 eq.) N-Boc-Arg.HCl (2,0 equiv .); N-Boc-Leu, H 2 O (2,0 equiv.); N-Boc-D-Nal (2) (1-5 equiv.)/HBt; N-Boc-Tyr (1,5 equiv.)/HBt ;N-Boc-Ser (tBu) (2,0 equiv.)/HBt;N-Bic-Trp (1,75 equiv.)/-HBt; N-Boc-His (Tos) (1,75 eq.)/HBt; (piro) Glu (2,5 eq.)/-HBt. Os procedimentos a seguir são usados ​​para separar o grupo N-protetor após cada adição. Programa A: polímero primeiro lavado com CH 2 Cl 2 1 x 1 min, TFA CH 2 Cl 2 (40/60) 1 x 1 min, TFA CH 2 Cl 2 (40/60) 1 x 30 min, CH 2 Cl 2 5 x 1 min, Et 3 N CH 2 Cl 2 (5/95) 3 x 1 min, CH 2 Cl 2 4 x 1 min. Programa B: polímero primeiro lavado com CH 2 Cl 2 1 x 1 min, 4,0-4,5 N HCl em CH 2 CL 2 /i-PrOH (1/1) 1 x 1 min, 4,0-4,5 n. HCl em CH 2 Cl 2 /i-PrOH (1/1) 1 x 30 min, CH 2 Cl 2 3 x 1 min, DMF 1 x 1 min, Et 3 N CH 2 Cl 2 (5/95) 3 x 1 min, DMF 1 x 1 min, CH2Cl2 4 x 1 min. O Programa A é usado para clivar grupos N-protetores em Gly, Pro, Arg, Leu, D-Nal (2) e Tyr. O Programa B é usado para clivar os grupos N-protetores em Ser, Trp e His, bem como para clivar o grupo protetor da cadeia lateral da serina. Após cada etapa de desproteção e lavagem de acordo com o Protocolo A ou B, o próximo aminoácido na sequência é adicionado à cadeia polipeptídica e o polímero é lavado com CH 2 Cl 2 3 x 1 min, MeOH 4 x 1 min, DMF 2 x 1 min e CH 2 Cl 2 4 x 1 min. Após o sequenciamento, o peptídeo é separado do polímero por tratamento com amônia saturada em metanol a cerca de 25°C por 18 horas. O peptídeo bruto é dissolvido em ácido acético 2M e convertido no sal acetato passando por uma coluna de AG3-X4A resina (Bio-Rad), após o que o acetato é dissolvido numa quantidade mínima de metanol e é adicionada acetona para precipitar o péptido. HPLC de fase reversa (Partisil ODS-3, 40 µm, acetonitrila com 0,5% de ácido acético) foi usada para remover impurezas polares e não polares. As frações contendo pelo menos 97% de acetato de naferelina foram reunidas e diluídas com água, depois carregadas em uma coluna de HPLC de fase reversa e lavadas com 1% de ácido acético em água. O resíduo é precipitado, filtrado, lavado e seco sob vácuo. A análise de aminoácidos é realizada em um analisador de aminoácidos Beckman 119CL. As amostras para análise de aminoácidos são hidrolisadas com 4N. Solução de CH 3 SO 3 H (0,2% -3-(2-aminometilindole)HCl) por 20 horas a 110°C. A HPLC analítica foi realizada em um cromatógrafo Spectra Physics 8800 usando uma coluna ODS-11 da Oltech, 5 µm, 4,6 x 250 mm, injeção de 10 µl, taxa de fluxo de 1,5 ml/min, 27,5% CH 3 CN, 72,5% 0,16 M KR 2 PO 4 , pH 5,1, temperatura 40°C A análise por HPLC do peptídeo bruto mostra um pico principal com um tempo de retenção de 18 minutos para nafarelina e sem impurezas na presença de 1% em tempo de retenção de 14 minutos. PRI mme R 2. Síntese de nafarelina sem proteção serina. O procedimento do Exemplo 1 foi repetido exceto que N-Boc-Ser foi usado em vez de N-Boc-Ser (tBu). A análise HPLC mostra um pico principal com um tempo de retenção de 18 minutos para nafarelina, bem como 8,1 a 11,5% de impurezas em um tempo de retenção (wu) de 14 minutos. Além disso, o rendimento desta síntese "desprotegida" é aproximadamente igual ao da síntese totalmente protegida usando tratamento com fluoreto de hidrogênio; neste último caso, o rendimento do produto é significativamente menor do que o obtido pela síntese de proteção temporária do Exemplo 1. EXEMPLO 3 Síntese de antagonistas de LH-RH usando proteção temporária com serina. Neste exemplo, antagonistas de LH-RH, N-Ac-D-Nal (2) D-pCl-Phe-Pal (3) Ser-Tyr-D-hArg (Et 2) Leu-hArg (Et 2) Prp-D - Ala NH 2 é preparado usando o seguinte protocolo de proteção de cadeia lateral: proteção salina contra L- e D-hArg (Et 2) (como cloreto) e proteção terc-butil serina. N-Boc-aminoácidos são obtidos de Bachem (Torrance, CA)) D-Ala, Arg e Leu); Star Biochemicals (Torrance, CA), (Pro); Synte Tech (Albany, Orgen) (D-Nal (2)), Inzel (Milwaukee, WI) (D-Pal (3)) e UCB Bioproducts (Bélgica) (p-Cl-Phe). Os aminoácidos são adicionados ao polímero Na-Boc-D-Ala da Preparação B na seguinte sequência: N-Boc-Pro (2,3 eq.); Na-Boc-hAtg (Et) 2 . HCl (1 eq.)/HBt; Na-Boc-Leu, H2O (2,3 eq.); Na-Boc-D-hArg (Et) 2 . HCl (1,6 eq.)/-HBt; Na-Boc-Tyr (2,1 eq.)/HBt; Na-Boc-Ser (tBu) (2,0 eq.); Na-Boc-D-Pal (3) (1,8 eq.)/HBt; Na-Boc-D-p-Cl-Phe (2,0 eq.); Na-Boc-D-Nal (2) (2,1 eq)/HBt; anidrido acético. A acetilação é realizada após Ala, Pro e Leu. Um excesso de HBt (2 eq.) é usado para ligar os aminoácidos básicos, hArg (Ey) 2 e Pal (3). Os aminoácidos são ligados por acoplamento DIC mediado por DIC ou HBt por 3 horas e o polímero é lavado sucessivamente com CH 2 Cl 2 3 x 1 min, MeOH 4 x 1 min, DMF 2 x 1 min e CH 2 Cl 2 4 x 1 min . O seguinte protocolo é usado para clivar o grupo protetor de N após cada adição de aminoácidos. Programa A: polímero primeiro lavado com CH 2 Cl 2 1 x 1 min, TFA CH 2 Cl 2 (40/60) 1 x 1 min, TFA CH 2 Cl 2 (40/60) 1 x 30 min, CH 2 Cl 2 5 x 1 min, Et 3 N CH 2 Cl 2 (5/95) 3 x 1 min, CH 2 Cl 2 4 x 1 min. Programa B: o polímero é primeiro lavado com CH 2 Cl 2 1 x 1 min, 4,0-4,5 N. HCl em CH 2 Cl 2 /-iPrOH (1/1) 1 x 1 min, 4,0-4,5 n. HCl em CH 2 Cl 2 /i-PrOH (1/1) 1 x 30 min, CH 2 Cl 2 3 x 1 min, DMF 1 x 1 min, Et 3 N CH 2 Cl 2 (5/95) 3 x 1 min, DMF 1 x 1 min, CH2Cl2 4 x 1 min. O programa A é usado para separar os grupos protetores em Ala. Pro, D-hArg (Et) 2 , Leu e D-Nal (2), o Programa B é usado para clivar os grupos protetores em D-hArg (Et) 2 , Tyr, Ser, D-Pal (3) e Phe. Após cada desproteção e lavagem, de acordo com o protocolo A ou B, o próximo aminoácido na sequência é adicionado e o polímero é lavado com CH 2 Cl 2 3 x 1 min, MeOH 4 x 1 min, DMF 2 x 1 min, CH 2 Cl2 4 x 1 min. Depois de completada a sequenciação, o péptido é separado do transportador polimérico por tratamento com amoníaco saturado em metanol durante aproximadamente 18 horas a uma temperatura de cerca de 25°C. O peptídeo bruto é primeiro dissolvido em ácido acético 2M e convertido em seu sal de acetato passando por uma coluna de resina AG3-X4A (Bio-Rad). O acetato é cromatografado em coluna de gel de sílica (CH 2 Cl 2 /i-PrOH/MeOH/H 2 O/HOAc como solvente); as frações de acetato foram dissolvidas em água e carregadas em uma coluna de fase reversa (Vydec c-18, 15-20 µm) e purificadas usando acetonitrila/TEAP (pH 3,0). As frações da pureza desejada foram reunidas e diluídas com água, depois carregadas em uma coluna de HPLC de fase reversa e depois lavadas com ácido acético a 1% em água. O péptido é dessorvido com MeOH/CH 3 CN/HOAc/H 2 O (44/50/1/5). O resíduo é retomado em metanol ou ácido acético e precipitado na presença de éter, filtrado, lavado com éter e seco in vacuo. A análise de aminoácidos é realizada em um analisador de aminoácidos Beckman 119CL. As amostras para análise de aminoácidos são hidrolisadas com HCl 6N. Solução de HCl a uma temperatura de cerca de 110 C por 20 horas. A HPLC analítica é realizada em um cromatógrafo Spectra Physics 8800 usando Spherisord C-8 (Oltech), 5 μm, 4,6 x 250 mm, injeção de 10 μl, consumo 1,5 ml / min , 30% RS 3 CN. 70% NH 4 H 2 PO 4 0,04 M, dimetiloctilamina 4,3 x 10 -3 , temperatura 40° C. A síntese do antagonista é confirmada pela presença de um pico principal em um tempo de retenção de 18 minutos; nenhum outro pico a 1% foi detectado em um tempo de retenção de 16 min. EXEMPLO 4 Síntese de um antagonista de LH-RH sem proteção serina transitória
O Exemplo 3 é repetido usando N-Boc-Ser em vez de N-Boc-Ser (tBu). A análise de HPLC mostra a presença de um pico maior em um tempo de retenção de 18 minutos em relação ao antagonista e a presença de uma impureza em uma concentração de 6,5% em relação a um tempo de retenção de 16 minutos. As reivindicações a seguir divulgam e declaram o objeto da solução técnica que o Requerente considera sua invenção. As reivindicações seguintes destinam-se a abranger toda a gama de soluções equivalentes reconhecidas pelos especialistas na matéria relacionadas com a síntese de péptidos em fase sólida.

A ligação peptídica tem as propriedades de uma ligação parcialmente dupla. Isso se manifesta em uma diminuição no comprimento desta ligação (0,132 nm) em comparação com o comprimento de uma ligação C N simples (0,147 nm). A natureza parcialmente dupla da ligação peptídica torna impossível que os substituintes girem livremente em torno dela, de modo que o grupo peptídico é planar e geralmente tem uma configuração trans (forma I). Assim, a espinha dorsal da cadeia peptídica é uma série de planos rígidos com uma articulação móvel ("articulada") no local onde estão localizados os átomos de C assimétricos (indicados por um asterisco na seção I).

A formação preferencial de certos confôrmeros é observada em soluções de peptídeos. Com o alongamento da cadeia, os elementos ordenados da estrutura secundária adquirem estabilidade mais pronunciada (semelhante às proteínas). A formação de uma estrutura secundária é especialmente típica para peptídeos regulares, em particular para poliaminoácidos.

Propriedades

Os oligopeptídeos são semelhantes em propriedades aos aminoácidos, os polipeptídeos são semelhantes às proteínas. Os oligopeptídeos são, via de regra, substâncias cristalinas que se decompõem quando aquecidas a 200-300 0 C. São altamente solúveis em água, ácidos e álcalis diluídos, quase insolúveis em solventes orgânicos. As exceções são oligopeptídeos construídos a partir de resíduos de aminoácidos hidrofóbicos.

Os oligopeptídeos possuem propriedades anfotéricas e, dependendo da acidez do meio, podem existir na forma de cátions, ânions ou zwitterions. As principais bandas de absorção no espectro de IV para o grupo NH são 3300 e 3080 cm -1 , para o grupo C=O 1660 cm -1 . No espectro UV, a banda de absorção do grupo peptídico está na região de 180-230 nm. O ponto isoelétrico (pI) dos peptídeos varia amplamente e depende da composição dos resíduos de aminoácidos na molécula. Os valores de pKa dos peptídeos são para a-COOH aprox. 3, para -H 2 aprox. 8.

As propriedades químicas dos oligopeptídeos são determinadas pelos grupos funcionais neles contidos, bem como pelas características da ligação peptídica. Suas transformações químicas são amplamente semelhantes às reações correspondentes dos aminoácidos. Eles dão uma reação biureto positiva e uma reação ninidrina. Os dipeptídeos e seus derivados (principalmente os ésteres) são facilmente ciclizados, transformando-se em dicetopiperazinas. Sob a ação do ácido clorídrico normal 5,7, os peptídeos são hidrolisados ​​em aminoácidos em 24 horas a 105 0 C.

Síntese de peptídeos

Na síntese de peptídeos, são utilizadas reações conhecidas da química orgânica para a preparação de amidas e métodos especialmente desenvolvidos para a síntese de peptídeos. Para a implementação bem-sucedida dessas sínteses, é necessário ativar o grupo carboxila, ou seja, aumentar a eletrofilicidade do carbono carbonílico. Isso é obtido pela modificação química do grupo carboxila dos aminoácidos. O tipo de tal modificação geralmente determina o nome do método de síntese de peptídeos.

1. Método do cloreto.

O método baseia-se na reação de obtenção de amidas pela interação de cloretos de ácidos com as aminas correspondentes. Foi assim que foram obtidos os primeiros peptídeos. Atualmente, esse método é usado muito raramente, pois é acompanhado pela formação de subprodutos e racemização de peptídeos.

2. Método de Azida

O material de partida neste método é na maioria das vezes o éster etílico de um aminoácido N-protegido, a partir do qual a hidrazida é obtida, a última é convertida com nitrito de sódio na presença de ácido clorídrico em azida ácida. Na reação, geralmente é utilizada a hidrazina, na qual um dos nitrogênios é bloqueado por um grupo protetor (Z-carbobenoxi ou grupo carbotretbutiloxi), o que evita a formação de di-hidrazidas laterais. As azidas interagem com aminoácidos C-protegidos em condições brandas para formar peptídeos.

A racemização neste método é minimizada, mas podem ocorrer reações colaterais, a saber: as azidas podem se rearranjar em isocianatos, que por sua vez, ao interagir com um álcool usado como solvente, formam uretanos.

3. Anidridos mistos

Anidridos de aminoácidos misturados com derivados de ácido carbônico, obtidos, por exemplo, usando clorocarbonato de isobutil, encontraram ampla aplicação na síntese de peptídeos:

A reação nesta síntese é realizada a baixa temperatura (-10..-20 C), de forma bastante rápida, o que reduz significativamente a possibilidade de formação de subprodutos e racemização. A síntese passo a passo rápida de peptídeos usando anidridos mistos é chamada de síntese REMA. Métodos de formação usando anidridos mistos são amplamente usados ​​na síntese de peptídeos em fase sólida.

Assim, a realização da síntese de peptídeos requer consideração e estrita observância de certos fatores. Assim, a fim de reduzir a formação de subprodutos e racemização, são recomendadas as seguintes condições típicas para a reação de formação de ligação peptídica:

1) o processo deve ser realizado em baixas temperaturas, o tempo de reação deve ser mínimo;

2) a massa de reação deve ter um pH próximo ao neutro;

3) bases orgânicas como piperidina, morfolina, etc. são usadas como reagentes de ligação de ácidos;

4) a realização da reação é desejável em meios anidros.

Síntese em fase sólida

Síntese em fase sólida - uma abordagem metódica para a síntese de oligômeros (polímeros) usando sólidos insolúveis operadora, que é um polímero orgânico ou inorgânico.

No início dos anos 1960, uma nova abordagem foi proposta para resolver os problemas de isolamento e purificação que surgem na síntese de peptídeos. Mais tarde, o autor da descoberta dessa abordagem, R.B. Merrifield, em sua palestra Nobel, descreveu como isso aconteceu: “Um dia tive a ideia de como o objetivo de uma síntese de peptídeos mais eficiente poderia ser alcançado. O plano era montar a cadeia peptídica em etapas, com a cadeia tendo uma extremidade ligada a um suporte sólido durante a síntese.” Como resultado, o isolamento e a purificação dos derivados de peptídeos intermediários e alvo foram reduzidos a uma simples filtração e lavagem completa do polímero sólido para remover todo o excesso de reagentes e subprodutos remanescentes na solução. Essa operação mecânica pode ser realizada quantitativamente, facilmente padronizada e pode até ser automatizada. Vamos considerar este procedimento com mais detalhes.

A síntese em fase sólida é baseada no fato de que o primeiro elo do futuro oligômero é ligado covalentemente ao grupo "âncora" H., a extensão da cadeia é realizada com monômeros protegidos padrão de acordo com os esquemas usuais usados ​​para síntese em soluções. Concluir. estágio de síntese. o oligômero é separado de N. e purificado por métodos apropriados. A síntese em fase sólida é usada principalmente. para obter polipeptídeos, oligonucleotídeos e oligossacarídeos.

Durante a síntese de polipeptídeos como N. naib. um copolímero de estireno e 1-2% de divinilbenzeno é amplamente utilizado, modificado pela introdução de um grupo âncora de cloreto de dimetoxibenzila para anexar o primeiro aminoácido (com um grupo N H 2 protegido) no C-terminal, por exemplo:

Após a remoção do grupo N-protetor, a extensão da cadeia polipeptídica é realizada por métodos padrão de síntese peptídica em solução (ver Peptídeos). Como agentes de condensação, Naib. as carbodiimidas são frequentemente usadas ou os aminoácidos são convertidos preliminarmente em ativador. éteres.

Na síntese de oligonucleotídeos, vidros macroporosos ou gel de sílica são usados ​​como ácidos nucléicos. O grupo âncora é um grupo carboxila, separado de N. spec. "perna", por exemplo:

B-purina ou base pirimidica

Na primeira etapa, o nucleosídeo está ligado ao carreador no grupo 3"-hidroxila da desoxirribose, no qual o grupo hidroxila na posição 5" é protegido pelo grupo dimetoxitritila (CH 3 OS 6 H 4) 2 (C 6 H 5) C (DMTr); a quantidade deste último após sua separação é facilmente medida espectrofotometricamente, o que serve como uma quantidade. característica do carregamento do transportador e permite avaliar os rendimentos nas etapas subsequentes da construção da cadeia de oligonucleotídeos. Após a remoção do grupo DMTr, a cadeia é montada usando fosfitamidas (fl. I; M. Kaposers, 1980) ou fosfonatos (hidrofosfonatos) (II; R. Stremberg, 1986):

Para a implementação da síntese em fase sólida, altos rendimentos (no nível de 96-99%) são necessários em cada etapa do distrito, bem como métodos eficazes de purificação e isolamento do sintetizador. conexões.

A utilização de uma fase sólida permite simplificar e acelerar significativamente cada etapa do crescimento da cadeia do oligómero, uma vez que a separação dos componentes em excesso, agentes de condensação e subprodutos na solução é conseguida por filtragem das reações. misturas e lavagem N. com um conjunto adequado de soluções. Assim, o processo de montagem da cadeia do oligômero se divide em várias operações padrão: desbloquear a extremidade crescente da cadeia, dosar o próximo monômero protegido e agente de condensação, alimentar esta mistura na coluna N. pelo tempo calculado e lavar fora o N. com um solvente adequado. O ciclo de construção de uma ligação monomérica m. b. automatizado.

No coração do automático baile de formatura. sintetizadores é um diagrama de circuito geral (ver. Fig.). numerosos os modelos de sintetizadores diferem no design das colunas e seu número, no método de fornecimento de reagentes e solventes, etc. O controle e a programação são realizados usando um computador embutido ou remoto.

Diagrama esquemático do dispositivo automático. baile de formatura. sintetizadores (a linha de controle elétrico é indicada por uma linha pontilhada): 1 - linha de alimentação de monômeros (M 1 , M n) e um agente de condensação (KA); 2-linha para alimentação de reagentes (ex: agentes oxidantes, agentes acilantes, to-t, etc.) e p-solventes (P 1 , P n); 3 - válvulas de comutação; 4 colunas com mídia, equipada com distribuição. válvula; 5-fotométrico célula; 6 metros; 7 unidades de controle e programação; 8-display.

O potencial de síntese em fase sólida foi demonstrado pela síntese de ribonuclease A (R. Merrifield, 1969) e hormônio de crescimento humano (D. Yamashiro, 1970), 124 e 183 aminoácidos de comprimento, respectivamente. No entanto, devido à pequena mas constante racemização que ocorre durante a formação de uma ligação peptídica, o sintetizador. proteínas têm um baixo biol. atividade, portanto automática. sintetizadores são usados ​​por Ch. arr. para obter polipeptídeos curtos (10-30 ligações), inclusive para preparação