HPLC høyytelses væskekromatografi. Liste over brukt litteratur

Ved høyytelses væskekromatografi (HPLC) er karakteren av prosessene som skjer i den kromatografiske kolonnen generelt identiske med prosessene i gasskromatografi. Den eneste forskjellen er bruken av væske som en stasjonær fase. På grunn av den høye tettheten av flytende mobile faser og den høye motstanden til kolonner, er gass- og væskekromatografi svært forskjellige i instrumentering.

Ved HPLC brukes vanligvis rene løsningsmidler eller blandinger derav som mobile faser.

For å lage en strøm av rent løsningsmiddel (eller blandinger av løsningsmidler), kalt et elueringsmiddel i væskekromatografi, brukes pumper som inngår i det hydrauliske systemet til kromatografen.

Adsorpsjonskromatografi utføres som et resultat av interaksjonen av et stoff med adsorbenter, slik som silikagel eller aluminiumoksid, som har aktive sentre på overflaten. Forskjellen i evnen til å samhandle med adsorpsjonssentrene til forskjellige prøvemolekyler fører til at de separeres i soner under bevegelse med den mobile fasen langs kolonnen. Soneseparasjonen av komponentene som oppnås i dette tilfellet avhenger av interaksjonen med både løsningsmidlet og adsorbenten.

De mest brukte i HPLC er silikageladsorbenter med forskjellige volumer, overflatearealer og porediametre. Aluminiumoksid og andre adsorbenter brukes mye sjeldnere. Hovedårsaken til dette:

utilstrekkelig mekanisk styrke, som ikke tillater pakking og bruk ved høye trykk karakteristisk for HPLC;

silikagel, sammenlignet med aluminiumoksid, har et bredere spekter av porøsitet, overflateareal og porediameter; Den betydelig større katalytiske aktiviteten til aluminiumoksid fører til forvrengning av analyseresultatene på grunn av dekomponering av prøvekomponenter eller deres irreversible kjemisorpsjon.

Detektorer for HPLC

Høyytelses væskekromatografi (HPLC) brukes til å oppdage polare ikke-flyktige stoffer som av en eller annen grunn ikke kan omdannes til en form som egner seg for gasskromatografi, selv i form av derivater. Slike stoffer inkluderer spesielt sulfonsyrer, vannløselige fargestoffer og noen plantevernmidler, for eksempel fenyl-urea-derivater.

Detektorer:

UV-detektor på en diodematrise. En "matrise" av fotodioder (mer enn to hundre av dem) registrerer konstant signaler i UV- og synlige områder av spekteret, og gir dermed opptak av UV-B-spektre i skannemodus. Dette lar deg kontinuerlig registrere, med høy følsomhet, uforvrengte spektre av komponenter som raskt passerer gjennom en spesiell celle.

Sammenlignet med enkeltbølgelengdedeteksjon, som ikke gir informasjon om topprenhet, gir muligheten til å sammenligne hele spektra av en diodegruppe en mye høyere grad av tillit til identifikasjonsresultatet.

Fluorescensdetektor. Den store populariteten til fluorescerende detektorer skyldes deres svært høye selektivitet og følsomhet, og det faktum at mange miljøgifter fluorescerer (f.eks. polyaromatiske hydrokarboner).

Elektrokjemisk detektor brukes til å oppdage stoffer som lett oksideres eller reduseres: fenoler, merkaptaner, aminer, aromatiske nitro- og halogenderivater, aldehyder, ketoner, benzidiner.

Kromatografisk separasjon av en blanding på en kolonne på grunn av den langsomme fremdriften av PF tar mye tid. For å fremskynde prosessen utføres kromatografi under trykk. Denne metoden kalles høyytelses væskekromatografi (HPLC)

Modernisering av utstyr brukt i klassisk væskekolonnekromatografi har gjort det til en av de mest lovende og moderne analysemetodene. Høyytelses væskekromatografi er en praktisk metode for separasjon, preparativ isolering og kvalitativ og kvantitativ analyse av ikke-flyktige termolabile forbindelser med både lav og høy molekylvekt.

Avhengig av typen sorbent som brukes, bruker denne metoden 2 kromatografialternativer: på en polar sorbent ved bruk av en ikke-polar eluent (direkte fasealternativ) og på en ikke-polar sorbent ved bruk av en polar eluent - den såkalte revers-fase høy -ytelse væskekromatografi (RPHPLC).

Under overgangen fra elueringsmiddel til elueringsmiddel etableres likevekt under HPLC-forhold mange ganger raskere enn under forhold med polare sorbenter og ikke-vandige PF-er. Som et resultat av dette, samt bekvemmeligheten av å arbeide med vandige og vandige alkohol-elueringsmidler, har OFVLC nå fått stor popularitet. De fleste HPLC-analyser utføres ved hjelp av denne metoden.

Detektorer. Utgangen fra en enkelt komponent fra kolonnen registreres ved hjelp av en detektor. For registrering kan du bruke en endring i ethvert analytisk signal som kommer fra mobilfasen og assosiert med typen og mengden av blandingskomponenten. Væskekromatografi bruker analytiske signaler som lysabsorpsjon eller lysemisjon av utgangsløsningen (fotometriske og fluorimetriske detektorer), brytningsindeks (refraktometriske detektorer), potensial og elektrisk ledningsevne (elektrokjemiske detektorer), etc.

Det kontinuerlig detekterte signalet tas opp av en opptaker. Et kromatogram er en sekvens av detektorsignaler registrert på et opptaksbånd, generert når individuelle komponenter i en blanding forlater kolonnen. Hvis blandingen er separert, er individuelle topper synlige på det eksterne kromatogrammet. Plasseringen av toppen i kromatogrammet brukes for å identifisere stoffet, høyden eller området til toppen - for kvantitativ bestemmelse.

Introduksjon

Kapittel 1. Grunnleggende begreper og klassifisering av væskekromatografimetoder

1.1 Utstyr for væskekromatografi

Kapittel 2. Essensen av HPLC

2.1 Søknad

Kapittel 3. Eksempler på bruk av HPLC i analyse av miljøobjekter

Kapittel 4. HPLC-utstyr

Litteratur

applikasjon

Introduksjon

Kromatografiske metoder viser seg ofte uunnværlig for identifisering og kvantifisering av organiske stoffer med lignende strukturer. Imidlertid er gasskromatografi og høyytelses væskekromatografi de mest brukte for rutineanalyse av miljøforurensninger. Gasskromatografisk analyse av organiske miljøgifter i drikkevann og avløpsvann var i utgangspunktet basert på bruk av pakkede kolonner, og senere ble kvarts-kapillærsøyler utbredt. Den indre diameteren til kapillærsøyler er vanligvis 0,20-0,75 mm, lengde - 30-105 m. Optimale resultater ved analyse av forurensninger i vann oppnås oftest ved bruk av kapillærsøyler med forskjellige filmtykkelser av metylfenylsilikoner med et fenylgruppeinnhold på 5 og 50 %. Det svake punktet ved kromatografiske teknikker ved bruk av kapillærkolonner er ofte prøveinnføringssystemet. Eksempler på introduksjonssystemer kan deles inn i to grupper: universelle og selektive. Universale inkluderer delte og splittløse injeksjonssystemer, "kald" injeksjon i kolonnen og fordampning med temperaturprogrammering. Når selektiv input brukes, rensing med mellomliggende fangst i en felle, headspace-analyse, etc. Ved bruk av universelle injeksjonssystemer kommer hele prøven inn i kolonnen; med selektiv injeksjon blir bare en viss fraksjon introdusert. Resultatene oppnådd med selektiv injeksjon er betydelig mer nøyaktige, siden fraksjonen som kommer inn i kolonnen inneholder kun flyktige stoffer, og teknikken kan automatiseres fullt ut.

Gasskromatografiske detektorer som brukes i forurensningsovervåking er ofte delt inn i universelle, som reagerer på hver komponent i mobilfasen, og selektive, som reagerer på tilstedeværelsen i mobilfasen av en viss gruppe stoffer med lignende kjemiske egenskaper. Universelle detektorer inkluderer flammeionisering, atomutslipp, massespektrometriske detektorer og infrarød spektrometri. Selektive detektorer som brukes i vannanalyse er elektronfangst (selektiv for stoffer som inneholder halogenatomer), termioniske (selektive for nitrogen- og fosforholdige forbindelser), fotoionisering (selektiv til aromatiske hydrokarboner), elektrolytisk ledningsevnedetektor (selektiv for forbindelser som inneholder halogenatomer). , svovel og nitrogen). Minimum påvisbare mengder stoffer varierer fra nanogram til pikogram per sekund.

Høyytelses væskekromatografi(HPLC) er en ideell metode for bestemmelse av et stort antall termisk labile forbindelser som ikke kan analyseres ved gasskromatografi. Moderne landbrukskjemikalier, som inkluderer metylkarbonater og organofosfor insektmidler, og andre ikke-flyktige stoffer, er ofte gjenstander for analyse ved bruk av væskekromatografi. Høyytelses væskekromatografi blir stadig mer utbredt blant andre metoder som brukes i miljøovervåking, også fordi den har strålende utsikter når det gjelder automatisering av prøvepreparering.

KAPITTEL 1. GRUNNLEGGENDE KONSEPT OG KLASSIFISERING AV VÆSKEKROMATOGRAFIMETODER

Væskekromatografi er delt inn i flere klasser avhengig av typen stasjonær fasebærer. Den enkle instrumenteringen av papir- og tynnsjiktskromatografi har ført til utbredt bruk av disse metodene i analytisk praksis. Imidlertid stimulerte de store egenskapene til kolonnevæskekromatografi forbedringen av utstyret for denne klassiske metoden og førte til den raske introduksjonen av HPLC. Passering av eluenten gjennom kolonnen under høyt trykk gjorde det mulig å dramatisk øke analysehastigheten og signifikant øke separasjonseffektiviteten på grunn av bruken av fint dispergert sorbent. HPLC-metoden tillater for tiden isolering, kvantitativ og kvalitativ analyse av komplekse blandinger av organiske forbindelser.

Basert på mekanismen for interaksjon av stoffet som separeres (elueres) med den stasjonære fasen, skilles adsorpsjon, fordeling, ionebytting, eksklusjon, ionepar, ligandbytte og affinitetskromatografi.

Adsorpsjonskromatografi. Separasjon ved adsorpsjonskromatografi utføres som et resultat av at stoffets interaksjon separeres med en adsorbent, slik som aluminiumoksid eller silikagel, som har aktive polare sentre på overflaten. Løsningsmidlet (elueringsmidlet) er en ikke-polar væske. Sorpsjonsmekanismen består av en spesifikk interaksjon mellom den polare overflaten til sorbenten og polare (eller i stand til polarisering) seksjoner av molekylene til den analyserte komponenten (fig. 1).

Ris. 1. Adsorpsjonsvæskekromatografi.

Partisjonskromatografi. I distribusjonsversjonen av væskekromatografi utføres separasjonen av en blanding av stoffer på grunn av forskjellen i deres fordelingskoeffisienter mellom to ikke-blandbare faser - eluenten (mobil fase) og fasen lokalisert på sorbenten (stasjonær fase).

På normal fase Fordelingsvæskekromatografi bruker et ikke-polart elueringsmiddel og polare grupper podet på overflaten av sorbenten (oftest silikagel). Substituerte alkylklorsilaner som inneholder polare grupper som nitril, aminogruppe, etc. brukes som silikageloverflatemodifikatorer (podede faser) (fig. 2). Bruken av podede faser gjør det mulig å finkontrollere sorpsjonsegenskapene til overflaten av den stasjonære fasen og oppnå høy separasjonseffektivitet.

Ris. 2. Partisjonskromatografi med podet fase (normalfasealternativ).

Omvendt fase væskekromatografi er basert på fordelingen av blandingskomponenter mellom et polart elueringsmiddel og ikke-polare grupper (lange alkylkjeder) podet på overflaten av sorbenten (fig. 3).

Ris. 3. Delingskromatografi med podet fase (alternativet omvendt fase).

En mindre utbredt variant av bærerfasevæskekromatografi er der en flytende stasjonær fase avsettes på en stasjonær bærer.

Eksklusiv (gel-penetrerende) kromatografi er en variant av væskekromatografi der separasjonen av stoffer skjer på grunn av fordelingen av molekyler mellom løsningsmidlet som befinner seg i porene til sorbenten og løsningsmidlet som strømmer mellom partiklene.

Affine kromatografi er basert på spesifikke interaksjoner av separerte proteiner (antistoffer) med stoffer (antigener) podet på overflaten av sorbenten (syntetisk harpiks), som selektivt danner komplekser (konjugater) med proteiner.

Ionebytte-, ionepar- og ligandbytterkromatografi brukes hovedsakelig i uorganisk analyse.

Grunnleggende parametere for kromatografisk separasjon.

Hovedparametrene for kromatografisk separasjon er retensjonsvolum og retensjonstid for blandingskomponenten (fig. 4).

Retensjonstiden tR er tiden som har gått fra det øyeblikket prøven er introdusert i kolonnen til maksimum av den tilsvarende toppen er frigjort. Ved å multiplisere retensjonstiden med den volumetriske hastigheten til eluenten F, får vi retensjonsvolumet VR:

Korrigert retensjonstid er tiden som har gått fra tilstedeværelsen av den maksimale toppen av den usorberte komponenten til toppen av den tilsvarende forbindelsen:

tR" = tR - to;

Det normaliserte eller korrigerte retensjonsvolumet er retensjonsvolumet korrigert for kolonnedødvolumet V0, dvs. retensjonsvolumet til den usorberte komponenten:

VR" = VR - V0;

Et kjennetegn ved retensjon er også kapasitetskoeffisienten k", definert som forholdet mellom massen til et stoff i den stasjonære fasen og massen til et stoff i den mobile fasen: k" = mn / mp;

k"-verdien kan enkelt bestemmes fra kromatogrammet:

De viktigste parameterne for kromatografisk separasjon er effektiviteten og selektiviteten.

Effektiviteten til kolonnen, målt ved høyden på teoretiske plater (HETP) og omvendt proporsjonal med antallet (N), er høyere, jo smalere toppen av stoffet frigjøres ved samme retensjonstid. Effektivitetsverdien kan beregnes fra kromatogrammet ved å bruke følgende formel:

N = 5,54 . (tR/1/2) 2 ,

Hvor tR- oppbevaringstid,

w 1/2 - toppbredde på halv høyde

Når du kjenner til antall teoretiske plater per kolonne, kolonnelengden L og den gjennomsnittlige sorbentkorndiameteren dc, er det enkelt å oppnå verdiene for høyden som tilsvarer den teoretiske platen (HETT) og den reduserte høyden (RHETT):

HETT = L/N PVET = HETT/d c

Disse egenskapene gjør det mulig å sammenligne effektiviteten til forskjellige typer kolonner, evaluere kvaliteten på sorbenten og kvaliteten på fyllingen av kolonnene.

Selektiviteten for å separere to stoffer bestemmes av ligningen:

Når man vurderer separasjonen av en blanding av to komponenter, er separasjonsgraden RS også en viktig parameter:

;

Topper anses som løst hvis RS-verdien er større enn eller lik 1,5.

De viktigste kromatografiske parameterne er relatert til følgende ligning for oppløsning:

;

Faktorene som bestemmer selektiviteten til separasjon er:

1) kjemisk natur av sorbenten;

2) sammensetningen av løsningsmidlet og dets modifiseringsmidler;

3) kjemisk struktur og egenskaper til komponentene i blandingen som separeres;

4) kolonnetemperatur

1.1 Utstyr for væskekromatografi

I moderne væskekromatografi brukes instrumenter av varierende grad av kompleksitet - fra de enkleste systemene til førsteklasses kromatografer utstyrt med forskjellige tilleggsenheter.

I fig. 4. Et blokkdiagram av en væskekromatograf er presentert, som inneholder det minste nødvendige settet med komponenter, i en eller annen form, til stede i et hvilket som helst kromatografisystem.

Ris. 4. Blokkdiagram av en væskekromatograf.

Pumpen (2) er designet for å skape en konstant strøm av løsemiddel. Dens design bestemmes først og fremst av driftstrykket i systemet. For å operere i området 10-500 MPa, brukes stempel- (sprøyte) eller stempelpumper. Ulempen med den første er behovet for periodiske stopp for å fylle med elueringsmiddel, og den andre er den større kompleksiteten til designet og, som en konsekvens, den høye prisen. For enkle systemer med lavt driftstrykk på 1-5 MPa brukes rimelige peristaltiske pumper med hell, men siden det er vanskelig å oppnå konstant trykk og strømningshastighet, er bruken begrenset til forberedende oppgaver.

Injektoren (3) sørger for at en prøve av en blanding av komponentene som separeres innføres i kolonnen med ganske høy reproduserbarhet. Enkle "stop-flow" prøveinjeksjonssystemer krever å stoppe pumpen og er derfor mindre praktiske enn sløyfepipettene utviklet av Reodyne.

HPLC-søylene (4) er tykkveggede rustfrie stålrør som tåler høye trykk. Tettheten og jevnheten av pakking av kolonnen med sorbent spiller en viktig rolle. Tykkveggede glasskolonner brukes med hell til lavtrykksvæskekromatografi. Konstant temperatur sikres av en termostat (5).

Detektorer (6) for væskekromatografi har en strømningscelle hvor en kontinuerlig måling av en eller annen egenskap ved den strømmende eluenten skjer. De mest populære typene generelle detektorer er refraktometre, som måler brytningsindeks, og spektrofotometriske detektorer, som måler absorbansen til et løsemiddel ved en fast bølgelengde (vanligvis i det ultrafiolette området). Fordelene med refraktometre (og ulemper med spektrofotometre) inkluderer lav følsomhet for typen forbindelse som bestemmes, som kanskje ikke inneholder kromoforgrupper. På den annen side er bruken av refraktometre begrenset til isokratiske systemer (med en konstant elueringsmiddelsammensetning), så bruken av en løsningsmiddelgradient i dette tilfellet er umulig.

HPLC-kolonner, som oftest brukes i analyse av miljøgifter, er 25 cm lange og har en indre diameter på 4,6 mm, og er pakket med 5-10 µm sfæriske silikagelpartikler podet med oktadecylgrupper. De siste årene har søyler med mindre indre diameter fylt med mindre partikler blitt tilgjengelig. Bruken av slike kolonner fører til en reduksjon i løsemiddelforbruk og analysetid, en økning i følsomhet og separasjonseffektivitet, og forenkler også problemet med å koble kolonner til spektraldetektorer. Søyler med en innvendig diameter på 3,1 mm er utstyrt med en sikkerhetspatron (pre-kolonne) for å øke levetiden og forbedre analytisk reproduserbarhet.

Detektorene som brukes i moderne HPLC-instrumenter er vanligvis en UV-diodearraydetektor, en fluorescerende detektor og en elektrokjemisk detektor.

Det bør huskes at i praktisk arbeid skjer separasjon ofte ikke gjennom en, men gjennom flere mekanismer samtidig. Dermed kan eksklusjonsseparasjon kompliseres av adsorpsjonseffekter, adsorpsjonsseparasjon ved distribusjonseffekter og omvendt. Dessuten, jo større forskjellen er mellom stoffene i prøven når det gjelder grad av ionisering, basicitet eller surhet, molekylvekt, polariserbarhet og andre parametere, jo større er sannsynligheten for en annen separasjonsmekanisme for slike stoffer.

I praksis er den mest utbredte "revers fase" (fordelings) kromatografi, der den stasjonære fasen ikke er polar, men den mobile fasen er polar (dvs. motsatt av "direkte fase" kromatografi).

I de fleste laboratorier rundt om i verden blir en gruppe på 16 prioriterte PAH-er analysert med HPLC eller CMS.

KAPITTEL 2. ESSENS AV HPLC

Ved HPLC brukes vanligvis rene løsningsmidler eller blandinger derav som mobile faser.

De mest brukte i HPLC er silikageladsorbenter med forskjellige volumer, overflatearealer og porediametre. Aluminiumoksid og andre adsorbenter brukes mye sjeldnere. Hovedårsaken til dette:

utilstrekkelig mekanisk styrke, som ikke tillater pakking og bruk ved høye trykk karakteristisk for HPLC;

silikagel, sammenlignet med aluminiumoksid, har et bredere spekter av porøsitet, overflateareal og porediameter; Den betydelig større katalytiske aktiviteten til aluminiumoksid fører til forvrengning av analyseresultatene på grunn av dekomponering av prøvekomponenter eller deres irreversible kjemisorpsjon.

Detektorer for HPLC

Detektorer:

Fluorescensdetektor. Den store populariteten til fluorescerende detektorer skyldes deres svært høye selektivitet og følsomhet, og det faktum at mange miljøgifter fluorescerer (f.eks. polyaromatiske hydrokarboner).

En elektrokjemisk detektor brukes til å oppdage stoffer som lett oksideres eller reduseres: fenoler, merkaptaner, aminer, aromatiske nitro- og halogenderivater, aldehyder, ketoner, benzidiner.

Detektorer. Utgangen fra en enkelt komponent fra kolonnen registreres ved hjelp av en detektor. For registrering kan du bruke en endring i ethvert analytisk signal som kommer fra mobilfasen og assosiert med typen og mengden av blandingskomponenten. Væskekromatografi bruker analytiske signaler som lysabsorpsjon eller lysemisjon av utgangsløsningen (fotometriske og fluorimetriske detektorer), brytningsindeks (refraktometriske detektorer), potensial og elektrisk ledningsevne (elektrokjemiske detektorer), etc.

2.1 Søknad

HPLC er mest brukt i følgende områder av kjemisk analyse (analyseobjekter der HPLC praktisk talt ikke har noen konkurranse er fremhevet):

Matkvalitetskontroll - tonika og smakstilsetningsstoffer, aldehyder, ketoner, vitaminer, sukker, fargestoffer, konserveringsmidler, hormonelle legemidler, antibiotika, triazin, karbamat og andre plantevernmidler, mykotoksiner, nitrosoaminer, polysykliske aromatiske hydrokarboner, etc.

Miljøvern - fenoler, organiske nitroforbindelser, mono- og polysykliske aromatiske hydrokarboner, en rekke plantevernmidler, hovedanioner og kationer.

Rettsmedisinsk - narkotika, organiske eksplosiver og fargestoffer, potente legemidler.

Farmasøytisk industri - steroidhormoner, nesten alle produkter av organisk syntese, antibiotika, polymerpreparater, vitaminer, proteinpreparater.

Medisin - de oppførte biokjemiske og medisinske stoffene og deres metabolitter i biologiske væsker (aminosyrer, puriner og pyrimidiner, steroidhormoner, lipider) for å diagnostisere sykdommer, bestemme hastigheten på eliminering av legemidler fra kroppen med henblikk på deres individuelle dosering.

Landbruk - bestemmelse av nitrat og fosfat i jord for å bestemme den nødvendige mengden gjødsel som brukes, bestemmelse av næringsverdien til fôr (aminosyrer og vitaminer), analyse av plantevernmidler i jord, vann og landbruksprodukter.

Biokjemi, bioorganisk kjemi, genteknologi, bioteknologi - sukkerarter, lipider, steroider, proteiner, aminosyrer, nukleosider og deres derivater, vitaminer, peptider, oligonukleotider, porfyriner, etc.

Organisk kjemi - alle stabile produkter av organisk syntese, fargestoffer, termolabile forbindelser, ikke-flyktige forbindelser; uorganisk kjemi (nesten alle løselige forbindelser i form av ioner og komplekse forbindelser).

kontroll av kvaliteten og sikkerheten til mat, alkoholholdige og ikke-alkoholholdige drikker, drikkevann, husholdningskjemikalier, parfymer i alle stadier av produksjonen;

bestemme arten av forurensning på stedet for en menneskeskapt katastrofe eller nødssituasjon;

påvisning og analyse av narkotiske, potente, giftige og eksplosive stoffer;

bestemmelse av tilstedeværelsen av skadelige stoffer (polysykliske og andre aromatiske hydrokarboner, fenoler, plantevernmidler, organiske fargestoffer, ioner av tunge, alkaliske og jordalkalimetaller) i flytende avløp, luftutslipp og fast avfall fra bedrifter og i levende organismer;

overvåking av prosesser for organisk syntese, olje- og kullraffinering, biokjemisk og mikrobiologisk produksjon;

analyse av jordkvalitet for gjødsling, tilstedeværelsen av plantevernmidler og ugressmidler i jord, vann og produkter, samt næringsverdien til fôr; komplekse forskningsanalytiske oppgaver; skaffe mikromengder av ultrarene stoffer.

KAPITTEL 3. EKSEMPLER PÅ BRUK AV HPLC I ANALYSE AV MILJØOBJEKTER

HPLC er en metode for overvåking av PAH i miljøobjekter

For polysykliske aromatiske hydrokarboner (PAH), økotoksiske stoffer av 1. fareklasse, er det etablert ekstremt lave nivåer av maksimalt tillatte konsentrasjoner (MAC) i naturlige gjenstander. Bestemmelsen av PAH på MPC-nivå og under er et av de mest komplekse analyseproblemene, og høyteknologiske analytiske metoder (GC-MS, GC, HPLC) brukes for å løse dem. Når du velger en metode for overvåking, legges til hovedkarakteristikkene - følsomhet og selektivitet, hastighet og effektivitet, fordi overvåking involverer serieanalyse. HPLC-alternativet på korte søyler med liten diameter oppfyller i stor grad disse kravene. Ved å bruke denne metoden utviklet og sertifiserte forfatterne metoder for overvåking av benzo[a]pyren i tre naturlige miljøer: aerosol, snødekke og overflatevann. Metodene kjennetegnes ved: enkel standardisert prøvepreparering, inkludert ekstraksjon av PAH med organiske løsemidler og konsentrasjon av ekstraktet, direkte innføring av det konsentrerte ekstraktet i en kromatografisk kolonne, bruk av fotometrisk deteksjon med flere bølgelengder i UV-området av spekteret, identifikasjon av PAH-topper i kromatogrammer ved hjelp av to parametere, retensjonstid og spektralforhold. Den totale feilen overstiger ikke 10 % ved bestemmelse av benzo[a]pyren i aerosol i konsentrasjonsområdet fra 0,3 til 450 ng/m3, i overflatevann i konsentrasjonsområdet fra 10 til 1000 ng/l, i snødekke i overflaten tetthet fra 0,5 til 50 μg/m2. For samtidig bestemmelse av prioriterte PAH-er (opptil 12 forbindelser) og registrering av inhomogene topper av analytter, ble gjentatt separasjon av ekstraktet foreslått ved å endre selektiviteten til mobilfasen, deteksjonsbølgelengden og kolonnetemperaturen, med hensyn til den enkelte egenskapene til PAH som bestemmes.

1 . Omgivelsesluftkvalitet. Massekonsentrasjon av benzo[a]pyren. Metodikk for å utføre målinger ved bruk av HPLC-metoden. Sertifiseringsbevis MVI nr. 01-2000.

2 . Kvalitet på overflate- og renset avløpsvann. Massekonsentrasjon av benzo[a]pyren. Metodikk for å utføre målinger ved bruk av HPLC-metoden. Sertifiseringssertifikat MVI nr. 01-2001.

3 . Kvaliteten på snødekket. Massekonsentrasjon av benzo[a]pyren. Metodikk for å utføre målinger ved bruk av HPLC-metoden. Sertifiseringssertifikat MVI nr. 02-2001.

Fjerning av anilin fra vandige løsninger ved bruk av avfall fra aluminotermisk reduksjon av møllen kobberskala

Problemet med å fjerne hydrokarboner fra avløpsvann er en presserende oppgave. I mange kjemiske, petrokjemiske og andre industrier dannes anilin og dets derivater, som er giftige stoffer. Anilin er et svært giftig stoff, MPC - 0,1 mg/m 3. Anilin og dets derivater er løselige i vann og kan derfor ikke fjernes ved gravitasjonssedimentering.

En av de beste metodene for å behandle avløpsvann fra organiske forurensninger er bruk av uorganiske og organiske adsorbenter som kan regenereres (aluminosilikater, modifisert leire, tre, fibre, etc.) og som ikke er i stand til å regenerere (aktivert karbon, makroporøse polymermaterialer, etc.). ).

Regenererbare adsorbenter kan fjerne organiske stoffer med forskjellig polaritet fra vann. Jakten på effektive adsorbenter er en presserende oppgave.

Denne rapporten presenterer resultatene av en studie innen bruk av valset kobberskala fra Jerevan Cable Plant (OPMOErKZ) som anilinsorbenter.

Kromatografiske studier ble utført på en HPLC-kromatograf / høyytelses væskekromatografi / systemer (Waters 486 - detektor, Waters 600S - kontroller, Waters 626 - Pump), på en 250 x 4 mm kolonne fylt med sorbentene vi studerte, den mobile fasehastigheten var 1 ml/m / mobil fase er løsningsmidlene vi studerer/, detektoren er UV-254. UV-spektroskopisk analyse ble utført på et Specord-50 spektrofotometer; spektrene ble oppnådd ved bruk av ASPECT PLUS-dataprogrammet.

Nøyaktig veide porsjoner av sorbenter ble tilsatt visse volumer av anilin i vann, hvis begynnelseskonsentrasjoner var varierte. Blandingen ble grundig ristet i 6 timer. Deretter fikk prøven sette seg. Adsorpsjonen er fullført nesten innen 48 timer Mengden utfelt anilin bestemmes ved UV-spektrofotometrisk samt refraktometrisk analyse.

Først ble adsorpsjonsegenskapene til OPMOErKZ studert når anilin ble fjernet fra en løsning i karbontetraklorid. Det viste seg at anilin absorberer sorbent 3 best (tabell).

Det ble også utført målinger for vandige løsninger av anilin i konsentrasjoner på 0,01-0,0001 mol/l. Tabellen viser data for en 0,01 M løsning.

Absorpsjon av anilin med forskjellige sorbenter fra en 0,01 M vandig løsning av anilin ved 20°C

Det ble tidligere fastslått at adsorpsjon innenfor de angitte konsentrasjonsområdene øker og lineært avhenger av brytningsindeksen. Mengden anilin ble bestemt fra det grafiske forholdet "brytningsindeks - molar konsentrasjon" og korrigert med data fra både væskekromatografi og UV-spektralanalyse.

Den mest aktive sorbenten for vandige løsninger er sorbent 3. Mengden adsorbert forurensning ble beregnet som differansen mellom den totale mengden forurensning som ble tilsatt den opprinnelige løsningen og resten av den i den endelige løsningen.

Metoder for å bestemme PAH i miljøobjekter

Vanligvis brukes gasskromatografi (GC) og høyytelses væskekromatografi (HPLC) metoder for å bestemme PAH. Separasjon av de viktigste 16 PAH-ene tilstrekkelig for kvantitativ analyse oppnås ved å bruke enten kapillærkolonner i gasskromatografi eller høyytelseskolonner brukt i HPLC. Det må huskes at en kolonne som godt skiller kalibreringsblandinger av seksten PAH-er ikke garanterer at de også vil være godt separert fra bakgrunnen til medfølgende organiske forbindelser i prøvene som studeres.

For å forenkle analysen, samt å oppnå resultater av høy kvalitet, inneholder de fleste analytiske prosedyrer et stadium med foreløpig isolasjon (separasjon) av PAH fra andre grupper av assosierte forbindelser i prøver. Oftest brukes lavtrykks væskekromatografimetoder for disse formålene i et væske-fast eller væske-væske system ved bruk av adsorpsjonsmekanismer, for eksempel ved bruk av silikagel eller aluminiumoksyd, noen ganger brukes blandede mekanismer, for eksempel adsorpsjon og eksklusjon ved bruk av Sephadex.

Bruken av foreløpig rensing av prøver gjør det mulig å unngå påvirkning av:

Helt upolare forbindelser som alifatiske hydrokarboner;

Moderat og sterkt polare forbindelser, for eksempel ftalan, fenoler, flerverdige alkoholer, syrer;

Høymolekylære forbindelser som harpikser.

Det er hovedsakelig to typer detektorer som brukes i høyytelses væskekromatografi (HPLC): en fluorimetrisk detektor eller en fotodiode array spektrofotometrisk detektor. Deteksjonsgrensen for PAH ved fluorimetrisk deteksjon er svært lav, noe som gjør denne metoden spesielt egnet for bestemmelse av spormengder av polyaromatiske forbindelser. Imidlertid gir klassiske fluorimetriske detektorer praktisk talt ingen informasjon om strukturen til forbindelsen som studeres. Moderne design gjør det mulig å registrere fluorescensspektra som er karakteristiske for individuelle forbindelser, men de er ennå ikke mye brukt i rutinemessig målingspraksis. En spektrofotometrisk detektor med en fotodiode array (PDL) gjør det mulig å registrere absorpsjonsspektre i UV og synlig spektralområde; disse spektrene kan brukes til identifikasjon. Lignende informasjon kan fås ved hjelp av raske skannedetektorer.

Ved valg av analytiske teknikker for separasjon, identifikasjon og kvantitativ analyse av disse PAH-ene, må følgende forhold tas i betraktning:

Nivået av bestemt innhold i testprøvene;

Antall relaterte stoffer;

Den analytiske prosedyren som brukes (måleteknikk);

Mulighetene til seriell utstyr.

Utvikling av en metode for å bestemme jordalkalielementer og magnesium ved bruk av ion høyytelses væskekromatografi

Utvikling og forbedring av metoder som gjør det mulig å løse problemer med vannanalyse er et viktig problem i analytisk kjemi. Utviklingen av høytrykks høyytelses væskekromatografi stimulerte utviklingen av en ny retning innen ionebytterkromatografi, den såkalte ionekromatografien. Syntesen av sorbenter for ionekromatografi er vanskelig, siden det er ganske mange krav til dem. På grunn av mangelen på kommersielt tilgjengelige svært effektive kationbyttere, ble det brukt en dynamisk modifisert omvendt fase, som en modifiseringsmiddel ble syntetisert for: N-heksadecyl-N-dekanoyl-paraminobenoylsulfonsyre etyl-diisopropylammonium (DHDAS), hvor det hydrofobe aminet som inneholder SO 3 - gruppe, i stand til kationbytte. Etter å ha passert modifiseringsløsningen, nådde absorpsjonen ved l = 260 nm 6,4 optiske tetthetsenheter (°E) og nådde et platå. Den beregnede ionebytterkapasiteten er 15,65 µmol. Siden kationer av jordalkalielementer og magnesium ikke absorberer i UV-området av spekteret, ble indirekte UV-deteksjon brukt ved å bruke et syntetisert UV-absorberende elueringsmiddel 1,4-dipyridiniumbutanbromid (DPB-bromid). Siden halogenioner ødelegger ståldelene av kolonnen, ble bromidionet av 1,4-dipyridiniumbutan erstattet med acetation. Når kolonnen vaskes med elueringsmidlet, erstattes motionen til modifiseringsmidlet, etyldiisopropylammonium, med det UV-absorberende ionet 1,4-dipyridiniumbutan. Separasjon av kationer ble utført ved optimal bølgelengde l = 260 nm på en skala på 0,4 A i "folding scale"-modus; Polariteten til opptakeren ble snudd. Separasjonen av alle studerte kationer ble oppnådd ved tilsetning av et kompleksdannende additiv - oksalsyre. Deteksjonsgrensene for Mg 2+, Ca 2+, Sr 2+, Ba 2+ er 8 μg/L; 16 ug/l; 34 ug/l; 72 µg/l henholdsvis. Under de valgte forholdene ble tappevann analysert, hvor innholdet av Ca 2+ var 10,6 + 1,9 mg-ion/l, Mg 2+ -2,5 + mg-ion/l. Reproduserbarhetsfeilen overstiger ikke -2,2 % for Ca 2+ og 1,4 % for Mg 2+.

Analyse av kadmiumkomplekser i miljøet

For å studere mekanismene for migrering av tungmetaller i biosfæren, kreves data om de kjemiske formene for eksistens av metaller i naturen. Vanskeligheter med å analysere forbindelser av et av de mest giftige metallene - kadmium - skyldes det faktum at det danner skjøre komplekser, og når man prøver å isolere dem, blir naturlige likevekter forvrengt. I dette arbeidet ble kadmiumforbindelser i jord og planter studert ved bruk av en teknikk basert på kromatografisk separering av ekstrakter etterfulgt av identifikasjon av komponenter ved kjemiske analysemetoder. Denne tilnærmingen gjorde det mulig ikke bare å identifisere de kjemiske formene av kadmium, men også å spore deres transformasjoner i miljøobjekter.

OH-gruppene av karbohydrater og polyfenoler (inkludert flavonoider), C=O, fosfater, NH 2 , NO 2 og SH-gruppene er koordinert med kadmium i biosfæreobjekter. For formålet med denne studien ble et sett med modellligander som representerer disse klassene av forbindelser kompilert. Interaksjonen mellom modellligander og vannløselige kadmiumsalter ble studert ved bruk av UV-spektroskopi og HPLC.

For å isolere kadmiumforbindelser ble det brukt ekstraksjon med spesielt utvalgte (ikke danner komplekser med Cd) løsemidler. Dette gjør det mulig å skille kadmium fra alle tungmetaller, bortsett fra sin nære kjemiske analog, sink. Topper som inneholder kadmium og sink i kromatogrammene til de oppnådde ekstraktene ble påvist ved å binde metaller i form av deres dithizonater. For å skille fra sink ble forskjellen i stabilitet av Cd- og Zn-komplekser ved pH 6-8 brukt. De isolerte Cd-forbindelsene ble identifisert ved HPLC ved bruk av pH-endringer under elueringsprosessen. Det ble foretatt en analyse av kadmiumforbindelser med komponenter av jord og plantevev, og stoffer produsert av planter som svar på økt tilførsel av kadmium fra jorda ble identifisert. Det er vist at flavonoider, spesielt tricin, er beskyttende midler i korn, alkoksyderivater av cystein i belgfrukter, og både polyfenoler og tioler i korsblomstrede grønnsaker.

KAPITTEL 4. HPLC-UTSTYR

ACCELA-SERIEN

Den nye ACCELA-væskekromatografen med ultrahøy ytelse er i stand til å operere over et bredt spekter av strømningshastigheter og trykk, og gir både typisk HPLC-separasjon på konvensjonelle kolonner og ultrarask og effektiv separering på kolonner med en partikkelstørrelse på sorbent på mindre enn 2 mikron ved ultrahøye trykk (mer enn 1000 atm.).

Systemet inkluderer en kvadrantgradientpumpe som er i stand til å generere trykk på over 1000 atm og med et retensjonsvolum på bare 65 µL, noe som muliggjør høyhastighets kromatografiske separasjoner. Autosampler ACCELA Kan operere med en prøveinjeksjonssyklus på 30 sekunder og gir den høyeste injeksjonsreproduserbarheten. Diode array detektor Accela PDA med et minimert strømningscellevolum (2 µl) optimalisert for høyhastighetskromatografi, bruker patentert LightPipe-teknologi og opprettholder de symmetriske toppformene som kommer med et feilfritt kromatografisystem og kolonner.

Systemet kobler sømløst sammen med massespektrometre for å skape de kraftigste og beste LC/MS-systemene som er tilgjengelige i verden.

1,9 µm UHP-søyler tilgjengelig fra Thermo Electron for alle bruksområder

TSP-SERIEN

Det modulære prinsippet for å konstruere HPLC-instrumenter lar kunden fleksibelt sette sammen utstyr for å løse eventuelle analytiske problemer, og hvis de endres, raskt og økonomisk modifisere det. Et bredt utvalg av moduler inkluderer pumper - fra isokratisk til fire-komponent gradient, fra mikrokolonne til semipreparativ, alle tilgjengelige detektorer, prøveinnføringssystemer - fra manuelle injektorer til autosamplere med mulighet for enhver manipulasjon med prøver, kraftig programvare for prosessering av måling resultater og administrere alle systemmoduler. Alle moduler er sertifisert av CSA, TUF/GS, FCC(EMI), VDE (EMI), ISO-9000, de er kompakte, har et moderne design, er enkle å betjene, utstyrt med innebygd display og selvdiagnose system, lar deg opprette og lagre oppgavemetoder parametere. De oppfyller kriteriene for "Eksemplarisk laboratoriepraksis" (GLP) og er inkludert i registeret over måleinstrumenter i den russiske føderasjonen. Målerapporter utstedes i samsvar med farmakopéene til England, USA, Tyskland og Frankrike.

TSP modulære systemer er preget av høyeste pålitelighet og stabilitet i drift.

Kombinasjonen av moduler gir analytikeren alle fordelene til et integrert system, på den ene siden, og fleksibiliteten til et modulært system, på den andre. Uansett bruksområde for High Performance Liquid Chromatography (HPLC) - farmakologi, bioteknologi, miljøanalyse, klinisk analyse,

Inneluft: kontroll- og rensemetoder. Kontroll av kilden til skadelige stoffer og miljøet. Gassanalysatorer: applikasjon og deres moderne typer for å overvåke sammensetningen av gassblandingen - universell fotometrisk væske og tape.

Overvåking som et system for å observere og kontrollere miljøet. Metoder for overvåking av miljøgifter i miljøobjekter.

Separasjon av anioner ved en-kolonne ionekromatografi. Bilde av strukturen til en ionebytterharpikspartikkel. Eksempler på bruk av ionebytterkromatografi ved analyse av miljøobjekter. Funksjoner ved ølanalyse ved bruk av ionekromatografi.

Generelle egenskaper til klororganiske forbindelser, deres viktigste fysiske og kjemiske egenskaper og bruksområder, negativ innvirkning på miljøet, kroppen til dyr, fisk og mennesker. Klororganiske plantevernmidler i mat og metoder for deres bestemmelse.

Grunnleggende om plan (tynt lag) kromatografi: tilstanden og utsiktene til å bruke moderne instrumentelle metoder for analyse av plantevernmidler, organiske klorpesticider i vann, mat, fôr og tobakksprodukter ved tynnsjiktskromatografi.

Metoder tilgjengelig for innsamling av innendørs luftprøver for analyse. Driftsprinsipp for kolorimetriske rør. En endring i farge på en bestemt reagens når den kommer i kontakt med en bestemt forurensning. Påvisning av flyktige organiske forbindelser.

Teoretisk grunnlag for strømningsmetri (luminescens), bruksområder i analyse av miljøobjekter og moderne utstyr for forskning. Ekstraordinær følsomhet og hastighet på luminescensanalyse. Problemer med eksitasjonsenergiforsyning.

Utviklingen av kjemisk analytisk utstyr eliminerer ikke bare problemet med kvaliteten på utførte målinger, men stiller tvert imot stadig høyere krav til alle aspekter ved målinger.

Generell informasjon om industrianlegget. Klimatiske forhold i området. Teknologisk kjede. Kilder til forurensning og forstyrrelse av naturmiljøet. Forurensning av naturlig vann. Observasjonspunkter for overflatevannkvalitet. Vannprøvetaking og analysemetoder.

Et bredt spekter av organiske forbindelser introdusert i miljøet i prosessen med menneskelig økonomisk aktivitet fører til det faktum at disse stoffene har blitt de viktigste forurensningene som bestemmer arten av teknogen forurensning av hydrosfæren.

Kjennetegn ved spektroskopiske analysemetoder. Essensen av ekstraksjon-fotometriske metoder. Eksempler på bruk av metode for bestemmelse av tungmetaller i naturlig vann. Metode for å identifisere bromidioner og nitrationer. Moderne utstyr.

Konseptet og formålet med gasskromatografi, dens retensjonsparametere. Retensjonstid og retensjonsvolum. Ligninger i gasskromatografi. Ekstra enheter for gasskromatografi. Luftforurensningskontroll i nødssituasjoner.

Konsept og egenskaper ved massespektrometrimetoden. Dobbeltfokuserende massespektrometre i induktivt koblet plasmamassespektrometri. Bruk av kromatografi-massespektrometri i identifisering av miljøgifter, utstyr.

Metoder for vurdering av forurensning av gassstrømmer. Grunnleggende krav til gassprøvetaking og analyse- og målemetoder. Metoder for vurdering av parametrisk forurensning. Metoder for vurdering av forurensning av vannmiljø, jord, grunn og vegetasjon. Identifisering av endringer.

Bestemmelse av tusendeler av en prosent av stoffinnholdet i rene metaller ved optiske analysemetoder ved bruk av adsorpsjonsmetoder for spektrofotometri, fotokolorimetri og kolorimetri. Salg av kjemisk analyseutstyr gjennom nettsider.

Formål og grunnleggende prinsipper for implementering av konduktometriske analysemetoder. Typer av metoder som brukes og funksjoner ved deres applikasjon. Eksempler på bruk av konduktometri ved analyse av miljøobjekter og nødvendig utstyr for dette.

I forhold til naturlige farvann vurderes problemene med kvantitativ bestemmelse og separering av hydrokarboner (CH) til menneskeskapte og naturlige komponenter.

Sorpsjonsmetoder for vannrensing brukes nå i økende grad, og en av de mest brukte sorbentene er aktivt karbon.

Grunnleggende typer kromatografi. Anvendelse av kromatografiske metoder i miljøovervåking. Anvendelse av kromatografi i analyse av miljøobjekter. Moderne maskinvaredesign. Metoder for utvikling av kromatogrammer og drift av en kromatograf.

Overvåking av naturlig vann ved fysiske og kjemiske metoder: plan (tynnsjiktskromatografi) og dens anvendelse for vannanalyse. Separasjon av en blanding av stoffer i et flatt lag av sorbent og løsemiddel. Luminescensintensiteten til petroleumsprodukter på et fluorimeter.

Introduksjon.

Den raske utviklingen av væskekromatografi de siste 10 årene skyldes hovedsakelig den intensive utviklingen av teoretiske grunnlag og den praktiske bruken av den svært effektive versjonen, samt opprettelsen og industriell produksjon av nødvendige sorbenter og utstyr.

Et særtrekk ved høyytelses væskekromatografi (HPLC) er bruken av sorbenter med en kornstørrelse på 3-10 mikron, som sikrer rask masseoverføring med svært høy separasjonseffektivitet.

For tiden har HPLC tatt førsteplassen blant instrumentelle metoder når det gjelder utviklingshastigheter, til og med over gasskromatografi. Den viktigste fordelen med HPLC sammenlignet med gasskromatografi er evnen til å studere nesten alle objekter uten noen begrensninger på deres fysisk-kjemiske egenskaper, for eksempel kokepunkt eller molekylvekt.

I dag er HPLC en godt utformet instrumentell metode som er mye brukt i en lang rekke felt innen vitenskap og teknologi. Dens betydning er spesielt stor i slike kritiske områder som biokjemi, molekylærbiologi, miljøforurensningskontroll, så vel som i den kjemiske, petrokjemiske, mat- og farmasøytiske industrien.

siden det er nødvendig å ta hensyn til en rekke svært spesifikke krav på grunn av følgende funksjoner i metodikken.

EN. HPLC-kolonner er pakket med media med svært liten partikkeldiameter. Som et resultat, ved de løsemiddelvolumetriske hastighetene som kreves for rask prøveseparering, dannes høyt trykk på kolonnen.

b. Detektorer som brukes i HPLC er følsomme for fluktuasjoner i eluentstrøm og trykk (støy). Ved bruk av konsentrasjonsdetektorer kreves det dessuten enda høyere stabilitet av elueringsmiddelets volumetriske hastighet.

V. Prosessen med kromatografisk separasjon er ledsaget av en rekke antagonistiske effekter, for eksempel fører dispersjon av prøven i den mobile fasen til blanding av de separerte komponentene og reduserer den maksimale konsentrasjonen av stoffet i den eluerte toppen (i detektoren). Dispersjon observeres i alle områder av systemet fra prøveinjeksjonspunktet til detektoren.

d. Løsemidler som fungerer som en mobil fase kan ofte forårsake korrosjon av utstyr. Dette gjelder først og fremst løsemidler som brukes i omvendt fasekromatografi, som foretrekkes i biokjemiske HPLC-applikasjoner.

Spesifikasjonene til HPLC som en instrumentell teknikk må tas i betraktning under utvikling, opprettelse og drift av disse systemene. Det tok mer enn ti år med søk og forskning for å lage kommersielle prøver av kromatografiske systemer og deres komponenter som er tilstrekkelig pålitelige, enkle og trygge å betjene med et akseptabelt forhold mellom pris og tekniske egenskaper. De siste trendene mot å redusere søyler (både lengde og diameter) tvinger nye krav til instrumenter.

1.1. EFFEKTIVITETOGselektivitet

Kromatografi er en metode for å separere komponentene i en blanding basert på forskjellen i likevektsfordelingen mellom to "ublandbare faser, hvorav den ene er stasjonær og den andre er mobil. Komponentene i prøven beveger seg langs kolonnen når de er i mobil fase, og forblir på plass når de er i den stasjonære fasen. Jo større affinitet komponenten har for den stasjonære fasen og jo mindre for den mobile fasen, jo saktere beveger den seg gjennom kolonnen og jo lenger beholdes den i den. På grunn av forskjellen i affiniteten til komponentene i blandingen for de stasjonære og mobile fasene, oppnås hovedmålet med kromatografi - separering av en akseptabel tidsperiode av blandingen i individuelle bånd (topper) av komponentene når de beveger seg langs kolonnen med den mobile fasen.

Fra disse generelle konseptene er det klart at kromatografisk separasjon bare er mulig hvis komponentene i prøven, som kommer inn i kolonnen når prøven introduseres, for det første er oppløst i den mobile fasen og for det andre interagerer (beholdt) med den stasjonære fasen . Hvis, ved innføring av en prøve, noen komponenter ikke er i form av en løsning, vil de bli filtrert og vil ikke delta i den kromatografiske prosessen. På samme måte vil komponenter som ikke interagerer med den stasjonære fasen passere gjennom kolonnen med den mobile fasen uten å separere i sine komponenter.

La oss akseptere betingelsen om at noen to komponenter er løselige i den mobile fasen og samvirker med den stasjonære fasen, det vil si at den kroiatografiske prosessen kan fortsette uten forstyrrelser. I dette tilfellet, etter å ha ført blandingen gjennom kolonnen, kan du få kromatogrammer av formen a, b eller V(Fig. 1.1). Disse kromatogrammene illustrerer kromatografiske separasjoner som varierer i effektivitet (EN og b) med lik selektivitet og selektivitet (b Og V) med lik effektivitet.

Jo smalere toppen oppnådd ved samme retensjonstid, desto høyere er kolonneeffektiviteten. Kolonneeffektivitet måles ved antall teoretiske plater (NPT) N: jo høyere effektivitet

Ris. 1.2. Kromatografiske toppparametre og beregning av antall teoretiske plater:

t R - topp retensjonstid; h - topphøyde; Wj/j - toppbredde ved halve høyden

Ris. 1.1. Type kromatogram avhengig av effektiviteten og selektiviteten til kolonnen:

EN- normal selektivitet, redusert effektivitet (færre teoretiske plater); b - vanlig selektivitet og effektivitet; V - normal effektivitet, økt selektivitet (høyere forhold mellom komponentretensjonstider)

effektivitet, jo større FTT, jo mindre utvidelse av toppen av det opprinnelige smale båndet når det passerer gjennom kolonnen, og jo smalere er toppen ved utgangen av kolonnen. PTT karakteriserer antall trinn for å etablere likevekt mellom den mobile og stasjonære fasen.

Kjenne til antall teoretiske plater per kolonne og lengden på kolonnen L (µm), så vel som gjennomsnittlig sorbentkorndiameter d c (µm), er det enkelt å oppnå verdiene for høyden som tilsvarer en teoretisk plate (HETT), samt den reduserte høyden tilsvarende en teoretisk plate (RHETT):

BETT = L/ N

PVETT =B3TT/d c .

Med verdiene til FTT, HETT og PHETT, kan man enkelt sammenligne effektiviteten til kolonner av forskjellige typer, forskjellige lengder, fylt med sorbenter av forskjellig natur og granularitet. Ved å sammenligne PTT for to kolonner av samme lengde, sammenlignes effektiviteten deres. Ved sammenligning av HETP sammenlignes kolonner med sorbenter av samme kornstørrelse og forskjellige lengder. Til slutt tillater PVETT-verdien at alle to kolonner kan evaluere kvaliteten på sorbenten, for det første og kvaliteten på fyllingen av kolonnene, og for det andre, uavhengig av lengden på kolonnene, granuleringen av sorbentene av dens natur.

Kolonneselektivitet spiller en stor rolle for å oppnå kromatografisk separasjon.

Selektiviteten til en kolonne avhenger av mange faktorer, og eksperimentørens ferdigheter bestemmes i stor grad av evnen til å påvirke separasjonsselektiviteten. For dette er tre svært viktige faktorer i hendene på kromatografen: valget av den kjemiske naturen til sorbenten, valget av sammensetningen av løsningsmidlet og dets modifiseringsmidler, og tar hensyn til den kjemiske strukturen og egenskapene til de separerte komponentene . Noen ganger har en endring i kolonnens temperatur, som endrer fordelingskoeffisienten til stoffer mellom den mobile og stasjonære fasen, en merkbar effekt på selektiviteten.

Når man vurderer og evaluerer separasjonen av to komponenter i et kromatogram, er oppløsning en viktig parameter. R s, som relaterer utgangstidene og toppbreddene til begge separerte komponenter

Oppløsning som en parameter som karakteriserer toppseparasjon øker når selektiviteten øker, reflektert av en økning i telleren, og effektiviteten øker, reflektert av en reduksjon i nevnerverdien på grunn av en reduksjon i bredden av toppene. Derfor førte den raske utviklingen av væskekromatografi til en endring i konseptet "høytrykksvæskekromatografi" - det ble erstattet av "høyoppløselig væskekromatografi" (mens den forkortede formen av begrepet på engelsk ble bevart HPLC som den mest korrekte karakteriserer utviklingsretningen for moderne væskekromatografi).

Dermed reduseres kolonnevaskingen og effektiviteten økes når en finere sorbent brukes, mer jevn i sammensetning (smal fraksjon), tettere og jevnere pakket i kolonnen, ved bruk av tynnere podefaselag, mindre viskøse løsningsmidler og optimale strømningshastigheter.

Men sammen med uskarphet av det kromatografiske sonebåndet under separasjonsprosessen i kolonnen, kan det også vaskes ut i prøveinnføringsanordningen, i den koblende kapillærinjektoren - kolonne og kolonne - detektor, i detektorcellen og i enkelte hjelpeenheter (mikrofiltre for å fange mekaniske partikler fra prøver installert etter injektoren, pre-kolonner, spiralreaktorer, etc.) - Jo større ekstra-kolonne volum sammenlignet med beholdt volum av toppen, jo større erosjon. Det har også betydning hvor dødvolumet er plassert: jo smalere det kromatografiske signalet er, desto større uskarphet i dødvolumet. Derfor bør det rettes spesiell oppmerksomhet til utformingen av den delen av kromatografien hvor den kromatografiske sonen er smalest (injektoren og enheter fra injektoren til kolonnen) - her er ekstrasøyleerosjon farligst og har størst påvirkning. Selv om det antas at i veldesignede kromatografer bør kildene til ekstra fortynning utenfor kolonnen reduseres til et minimum, men hver ny enhet, må hver modifikasjon av kromatografen nødvendigvis avsluttes med testing på en kolonne og sammenligning av det resulterende kromatogrammet. med passet en. Hvis toppforvrengning eller en kraftig reduksjon i effektivitet observeres, bør kapillærer og andre enheter som nylig er introdusert i systemet inspiseres nøye.

Utvasking utenfor kolonne og feilvurdering kan føre til et betydelig (over 50 %) tap av effektivitet, spesielt i tilfeller der relativt gamle kromatografer forsøkes brukt til høyhastighets HPLC, mikrokolonne HPLC og andre varianter av moderne HPLC som krever mikroinjektorer, forbinder kapillærer med indre med en diameter på 0,05-0,15 mm av minimumslengde, kolonner med en kapasitet på 10-1000 µl, detektorer med mikrokyvetter med en kapasitet på 0,03-1 µl og med høyhastighets, høyhastighetsopptakere og integratorer .

1.2. LØSNINGSMIDDELBEHOLDNING OG STYRKE

For at analyttene skal separeres på kolonnen, som nevnt ovenfor, kapasitetskoeffisienten k" må være større enn 0, dvs. stoffer må holdes tilbake av den stasjonære fasen, sorbenten. Kapasitetsfaktoren bør imidlertid ikke være for høy til å oppnå en akseptabel elueringstid. Hvis det for en gitt blanding av stoffer velges en stasjonær fase som beholder dem, så består videre arbeid med å utvikle en analyseteknikk i å velge et løsningsmiddel som ideelt sett ville gitt forskjellig for alle komponentene, men akseptabelt ikke veldig stort. k". Dette oppnås ved å endre elueringsstyrken til løsningsmidlet.

Ved adsorpsjonskromatografi på silikagel eller aluminiumoksid økes som regel styrken til et to-komponent løsningsmiddel (for eksempel heksan med tilsetning av isopropanol) ved å øke innholdet av den polare komponenten (isopropanol), eller redusert ved å redusere isopropanolinnholdet. Hvis den polare komponenten som inneholder blir for liten (mindre enn 0,1%), bør den erstattes med en svakere elueringskraft. Det samme gjøres ved å erstatte enten en polar eller en ikke-polar komponent med andre, selv om dette systemet ikke gir den ønskede selektiviteten med hensyn til komponentene av interesse i blandingen. Ved valg av løsningsmiddelsystemer tas både løseligheten til komponentene i blandingen og den eluotrope serien av løsningsmidler sammenstilt av forskjellige forfattere i betraktning.

Styrken til løsningsmidlet velges på omtrent samme måte ved bruk av podede polare faser (nitril, amino, diol, nitro, etc.), under hensyntagen til mulige kjemiske reaksjoner og utelukker løsemidler som er farlige for fasen (for eksempel ketoner for aminofase).

Ved omvendt fasekromatografi økes løsemiddelstyrken ved å øke innholdet av den organiske komponenten i elueringsmidlet (metanol, acetonitril eller THF) og reduseres ved å tilsette mer vann. Hvis det ikke er mulig å oppnå ønsket selektivitet, bruker de en annen organisk komponent eller prøver å endre den ved hjelp av ulike tilsetningsstoffer (syrer, ioneparreagenser, etc.).

Ved separasjoner ved bruk av ionebytterkromatografi endres løsningsmidlets styrke ved å øke eller redusere konsentrasjonen av bufferløsningen eller endre pH; i noen tilfeller brukes modifikasjon med organiske stoffer.

Men spesielt ved komplekse naturlige og biologiske blandinger er det ofte ikke mulig å velge styrken på løsningsmidlet på en slik måte at alle prøvekomponentene eluerer innen en akseptabel tid. Da må du ty til gradienteluering, dvs. bruke et løsemiddel hvis elueringsstyrke endres under analyseprosessen slik at den stadig øker i henhold til et forhåndsbestemt program. Denne teknikken gjør det mulig å oppnå eluering av alle komponenter i komplekse blandinger på relativt kort tid og deres separasjon i komponenter i form av smale topper.

1.3. SORBENT Partikkelstørrelse, PERMEABILITET OG EFFEKTIVITET

Med tanke på erosjonen i kolonnen, indikerte vi at effektiviteten til kolonnen (HETT) avhenger av størrelsen på sorbentpartiklene. I stor grad skyldtes den raske utviklingen av HPLC de siste 10-12 årene for det første utviklingen av metoder for å produsere sorbenter med partikkelstørrelser fra 3 til 10 mikron og med en smal fraksjonert sammensetning, som gir høy effektivitet med god permeabilitet, og for det andre utviklingsmetodene for å fylle kolonner med disse sorbentene og for det tredje utvikling og serieproduksjon av væskekromatografer med høytrykkspumper, injektorer og detektorer med små volum kyvetter som er i stand til å registrere små volumtopper.

For godt pakkede slampakkede kolonner kan den reduserte ekvivalente teoretiske platehøyden (LPHE) være 2 uavhengig av om det brukes 3, 5, 10 eller 20 μm partikler til pakking. I dette tilfellet vil vi motta henholdsvis kolonner (med en standardlengde på 250 mm) med en effektivitet på 41670, 25000, 12500 og 6250 t.t. Det virker naturlig å velge den mest effektive kolonnen pakket med 3 µm partikler. Denne effektiviteten vil imidlertid komme på bekostning av drift med meget høyt trykk og relativt lav separasjonshastighet, siden den eksisterende pumpen mest sannsynlig vil kunne pumpe løsemiddel gjennom en slik kolonne med høy volumetrisk hastighet. Her står vi overfor spørsmålet om forholdet mellom partikkelstørrelsen til sorbenten, effektiviteten og permeabiliteten til kolonnene.

Hvis vi uttrykker kolonnemotstandsfaktoren herfra - en dimensjonsløs mengde, får vi følgende ligning:

Resistensfaktoren for kolonner pakket med mikropartikler av samme type ved bruk av samme metode varierer litt og er følgende verdier:

Partikkeltype "... Uregelmessig sfærisk

skjema

Tørr emballasje. . . . . 1000-2000 800-1200

Suspensjonsemballasje. . . 700-1500 500-700

Kolonneinnløpstrykket er proporsjonalt med den lineære strømningshastigheten, kolonnedragfaktoren, løsningsmiddelviskositeten og kolonnelengden og omvendt proporsjonal med kvadratet av partikkeldiameteren.

Ved å anvende dette forholdet på de ovenfor beskrevne kolonnene med partikler med diametre på 3, 5, 10 og 20 µm og forutsatt konstant lineær strømningshastighet, kolonnemotstandsfaktor og løsningsmiddelviskositet, oppnår vi et innløpstrykkforhold på 44:16:4:1 for søyler av lik lengde. Således, hvis for en omvendt-fase sorbent med en partikkelstørrelse på 10 μm ved bruk av metanolløsningsmiddelsystemer - . vann (70:30) vanligvis på en standard kolonne med en løsemiddelstrømhastighet på 1 ml/min, trykket ved inngangen til kolonnen er 5 MPa, deretter for partikler på 5 μm - 20 MPa og for 3 μm - 55 MPa . Ved bruk av silikagel og et mindre viskøst løsningsmiddelsystem, heksan - isopropanol (100:2), vil verdiene være betydelig lavere: henholdsvis 1, 4 og 11 MPa. Hvis bruken av partikler med en størrelse på 3 μm er svært problematisk i tilfelle av en omvendt fase-sorbent, og 5 μm er mulig, men ikke på alle enheter, er det ingen problemer med trykk for en normalfase-sorbent. Det skal bemerkes at moderne høyhastighets HPLC vanligvis bruker en høyere løsemiddelstrøm enn i eksemplet ovenfor, så trykkkravene øker enda mer.

Men i tilfeller hvor det kreves et visst antall teoretiske plater for separasjon og det er ønskelig å gjennomføre rateanalyse, endrer bildet seg noe. Siden lengdene på kolonner med sorbenter med kornstørrelser på 3, 5, 10 mikron, med lik effektivitet, vil være henholdsvis 7,5; 12,5 og 25 cm, så vil trykkforholdet ved innløpet til søylene endres til 3:2:1. Følgelig vil varigheten av analyse på slike kolonner med lik effektivitet være i forholdet 0,3:0,5:1, det vil si at når man beveger seg fra 10 til 5 og 3 mikron, vil analysens varighet reduseres med 2 og 3,3 ganger. Denne raskere analysen kommer på bekostning av forholdsmessig høyere trykk ved kolonneinnløpet.

Dataene som presenteres er gyldige for de tilfellene der sorbenter av forskjellige kornstørrelser har samme partikkelstørrelsesfordelingskurver, kolonnene er pakket på samme måte og har samme kolonnemotstandsfaktor. Det bør tas i betraktning at vanskeligheten med å oppnå smale fraksjoner av sorbenten øker når partikkelstørrelsen avtar og det. Fraksjoner fra forskjellige produsenter har ulik brøksammensetning. Derfor vil kolonnemotstandsfaktoren variere avhengig av kornstørrelse, sorbenttype, kolonnepakkingsmetode osv.

KLASSIFISERING AV HPLC-METODER VED SEPARASJONSMEKANISME

De fleste separasjoner utført ved HPLC er basert på en blandet mekanisme for interaksjon av stoffer med en sorbent, noe som gir større eller mindre retensjon av komponenter i kolonnen. Separasjonsmekanismer i mer eller mindre ren form er ganske sjeldne i praksis, for eksempel adsorpsjon ved bruk av absolutt vannfri silikagel og vannfri heksan for å skille aromatiske hydrokarboner.

Med en blandet retensjonsmekanisme for stoffer med forskjellig struktur og molekylvekt er det mulig å vurdere bidraget til retensjon av adsorpsjon, distribusjon, eksklusjon og andre mekanismer. For en bedre forståelse og forståelse av separasjonsmekanismene i HPLC, er det imidlertid tilrådelig å vurdere separasjoner med en overvekt av en eller annen mekanisme som relatert til en bestemt type kromatografi, for eksempel ionebytterkromatografi.

2.1.1 ADSORPTIONSKROMATOGRAFI

Separasjon ved adsorpsjonskromatografi utføres som et resultat av interaksjonen av et stoff med adsorbenter, slik som silikagel eller aluminiumoksid, som har aktive sentre på overflaten. Forskjellen i evnen til å samhandle med adsorpsjonssentrene til forskjellige prøvemolekyler fører til at de separeres i soner under bevegelse med den mobile fasen langs kolonnen. Soneseparasjonen av komponentene som oppnås i dette tilfellet avhenger av interaksjonen med både løsningsmidlet og adsorbenten.

Sorpsjon på overflaten av en adsorbent som inneholder hydroksylgrupper er basert på en spesifikk interaksjon mellom den polare overflaten til adsorbenten og polare (eller polariserbare) grupper eller seksjoner av molekyler. Slike interaksjoner inkluderer dipol-dipol-interaksjon mellom permanente eller induserte dipoler, dannelsen av en hydrogenbinding, opp til dannelsen av r-komplekser eller ladningsoverføringskomplekser. En mulig og ganske hyppig forekomst i praktisk arbeid er manifestasjonen av kjemisorpsjon, noe som kan føre til en betydelig økning i retensjonstid, en kraftig reduksjon i effektivitet, utseende av nedbrytningsprodukter eller irreversibel sorpsjon av stoffet.

Adsorpsjonsisotermer av stoffer har en lineær, konveks eller konkav form. Med en lineær adsorpsjonsisoterm er toppen av stoffet symmetrisk og retensjonstiden avhenger ikke av prøvestørrelsen. Oftest er adsorpsjonsisotermer av stoffer ikke-lineære og har en konveks form, noe som fører til en viss asymmetri av toppen med dannelsen av en hale.

De mest brukte i HPLC er silikageladsorbenter med forskjellige porevolum, overflatearealer og porediametre. Aluminiumoksid brukes mye sjeldnere, og andre adsorbenter, mye brukt i klassisk kolonne- og tynnsjiktskromatografi, brukes ekstremt sjelden. Hovedårsaken til dette er den utilstrekkelige mekaniske styrken til de fleste andre adsorbenter, som ikke tillater at de pakkes eller brukes ved høye trykk som er karakteristiske for HPLC.

De polare gruppene som forårsaker adsorpsjon og er lokalisert på overflaten av silikagel og aluminiumoksid er like i egenskaper. Derfor er vanligvis rekkefølgen for eluering av blandinger av stoffer og den eluotrope serien av løsemidler den samme for dem. Forskjellen i den kjemiske strukturen til silikagel og aluminiumoksid fører imidlertid noen ganger til forskjeller i selektivitet – da foretrekkes en eller annen adsorbent som er mer egnet for en gitt spesifikk oppgave. For eksempel gir alumina større selektivitet for separering av visse polynukleære aromatiske hydrokarboner.

Preferansen som vanligvis gis til silikagel sammenlignet med aluminiumoksid forklares av et bredere utvalg av silikageler når det gjelder porøsitet, overflate og porediameter, samt den betydelig høyere katalytiske aktiviteten til aluminiumoksid, som ofte fører til forvrengning av analyseresultatene på grunn av dekomponering av prøvekomponenter eller deres irreversible kjemisorpsjon.

2.1.2 Ulemper ved adsorpsjonskromatografi som begrenser bruken

Populariteten til adsorpsjonskromatografi avtok gradvis etter hvert som HPLC-metoden utviklet seg; den ble i økende grad erstattet og fortsetter å bli erstattet av andre alternativer, for eksempel omvendt fase og normalfase HPLC på sorbenter med podet fase. Hva er ulempene med adsorpsjonskromatografi som førte til dette?

Først av alt er dette den lange varigheten av prosessene for å ekvilibrere adsorbenter med løsemidler som inneholder vann i spormengder, vanskeligheten med å tilberede slike løsningsmidler med en viss og reproduserbar fuktighet. Dette resulterer i dårlig reproduserbarhet av retensjons-, oppløsnings- og selektivitetsparametere. Av samme grunn er det umulig å bruke gradienteluering - returen til utgangstilstanden er så lang at den betydelig overskrider tiden som er vunnet ved å bruke en gradient.

Betydelige ulemper ved adsorbenter, spesielt aluminiumoksyd, forbundet med hyppige tilfeller av omorganiseringer av forbindelser som er følsomme for katalyse, deres nedbrytning og irreversibel sorpsjon, er også velkjente og har gjentatte ganger blitt notert i litteraturen. Irreversibelt sorberte stoffer, som samler seg ved den første delen av kolonnen, endrer sorbentens natur og kan føre til en økning i motstanden til kolonnen eller til og med til fullstendig tilstopping. Den siste ulempen kan elimineres ved å bruke en pre-kolonne, som Av- Etter hvert som motstanden og tilstoppingen øker, erstattes den med en ny* eller fylles på igjen med en ny sorbent. Imidlertid resulterer irreversibel sorpsjon, som også forekommer i dette tilfellet, i et kromatogram der prøvekomponenter som er følsomme for sorpsjon eller katalytisk dekomponering er helt eller delvis fraværende.

2.2. DISTRIBUSJONSKROMATOGRAFI

Delingskromatografi er en variant av HPLC der separasjonen av en blanding i komponenter utføres på grunn av forskjellen i deres fordelingskoeffisienter mellom to ikke-blandbare faser: et løsningsmiddel (mobil fase) og en fase på sorbenten (stasjonær fase). Historisk sett var de første sorbenter av denne typen, som ble oppnådd ved å påføre væskefaser (oksydipropionitril, parafinolje, etc.) på porøse bærere, lik hvordan sorbenter ble og er forberedt for gass-væskekromatografi (GLC). Imidlertid ble ulempene med slike sorbenter umiddelbart avslørt, hvor den viktigste var den relativt raske skyllingen av fasen fra bæreren. På grunn av dette avtok mengden av fase i kolonnen gradvis, retensjonstidene ble også redusert, og adsorpsjonssentre som ikke var dekket av fasen dukket opp i den første delen av kolonnen, noe som forårsaket dannelsen av topphaler. Denne ulempen ble bekjempet ved å mette løsningsmidlet med den påførte fasen før det kom inn i kolonnen. Medriving ble også redusert når mer viskøse og mindre løselige polymerfaser ble brukt, men i dette tilfellet, på grunn av vanskeligheten med diffusjon fra tykke polymerfilmer, ble kolonneeffektiviteten markant redusert.

Det viste seg å være logisk å pode væskefasen på bæreren gjennom kjemiske bindinger på en slik måte at fjerning av den blir fysisk umulig, dvs. å gjøre bæreren og fasen til ett - til den såkalte podefasesorbenten.

Etterfølgende innsats fra forskere var rettet mot å søke etter reagenser hvis poding ville foregå ganske raskt og fullstendig, og bindingene som ble dannet ville være så stabile som mulig. Slike reagenser var alkylklorsilaner og deres derivater, som gjorde det mulig, ved å bruke en lignende teknologi, å oppnå podefasesorbenter av forskjellige typer og med forskjellige polare og ikke-polare grupper på overflaten.

Den vellykkede påføringen av sistnevnte type sorbenter for HPLC har bidratt til veksten av produksjonen deres av en lang rekke produsenter. Hvert selskap produserte slike sorbenter, som regel, basert på sin egen type silikagel og ved hjelp av sin egen teknologi, som vanligvis utgjør produksjons-"knowhow". Som et resultat har et stort antall sorbenter, kjemisk kalt nøyaktig det samme (for eksempel oktadecylsilan-podet silikagel), svært forskjellige kromatografiske egenskaper. Dette skyldes det faktum at silikagel kan ha bredere eller smalere porer, en annen overflate, porøsitet, overflaten før poding kan hydroksyleres eller ikke, mono-, di- eller triklorsilaner kan podes, podeforhold kan gi monomere, polymere eller blandet lag fase, forskjellige metoder brukes for å fjerne gjenværende reagenser, ytterligere deaktivering av silanol og andre aktive grupper kan eller ikke kan brukes.

Kompleksiteten til teknologien for poding av reagenser og forberedelse av råvarer og materialer, dens flertrinns natur, fører til at selv partier av sorbenter oppnådd ved bruk av samme teknologi fra ett produksjonsselskap kan ha litt forskjellige kromatografiske egenskaper. Dette gjelder spesielt i tilfeller der slike sorbenter brukes til analyse av flerkomponentblandinger som inneholder stoffer som avviker markant i antall og plassering av funksjonelle grupper, og type funksjonalitet.

Med hensyn til ovenstående bør man alltid tilstrebe å sikre at ved bruk av analyseteknikken beskrevet i litteraturen, brukes samme sorbent og samme driftsforhold. I dette tilfellet er sannsynligheten for at verket ikke blir reprodusert minimal. Hvis dette ikke er mulig, men en sorbent fra et annet selskap med en lignende podet fase blir tatt, må du være forberedt på at det vil ta lang tid å omarbeide teknikken. Samtidig er det en mulighet (og det bør tas i betraktning) at med denne sorbenten, selv etter lang utvikling, kan den nødvendige separasjonen ikke oppnås. Tilstedeværelsen i litteraturen av mange beskrevne separasjonsteknikker på gamle sorbenter som har blitt produsert i lang tid stimulerer deres videre produksjon og bruk av denne grunn. Men i tilfeller der det er nødvendig å gå videre til utviklingen av originale metoder, spesielt i forhold til stoffer som er utsatt for nedbrytning, kjemisorpsjon, omorganiseringer, er det tilrådelig å begynne å arbeide med sorbenter som er utviklet nylig og produsert ved hjelp av nye, forbedrede versjoner av teknologien. Nye sorbenter har en jevnere fraksjonert sammensetning, mer jevn og fullstendig overflatedekning med den podede fasen, og mer avanserte sluttstadier av sorbentbehandlingen.

2.3. IONEBYTTE KROMATOGRAFI

Ved ionebytterkromatografi oppnås separasjonen av blandingskomponenter gjennom den reversible interaksjonen mellom ioniserende stoffer og de ioniske gruppene i sorbenten. Bevaring av den elektriske nøytraliteten til sorbenten sikres ved tilstedeværelsen av motioner som er i stand til ionebytte, plassert i umiddelbar nærhet av overflaten. Ionet til den innførte prøven, som interagerer med den faste ladningen til sorbenten, utveksler med motionet. Stoffer med ulik affinitet for faste ladninger separeres på anionbyttere eller kationbyttere Anionbyttere har positivt ladede grupper på overflaten og sorberer anioner fra mobilfasen Kationbyttere inneholder følgelig grupper med -negativ ladning som interagerer med kationer.

Som en mobil fase brukes vandige løsninger av salter av syrer, baser og løsemidler som flytende ammoniakk, det vil si løsemiddelsystemer med høy dielektrisk konstant e og større tendens til å ionisere forbindelser. De fungerer vanligvis med bufferløsninger som tillater pH verdi som skal justeres.

Under kromatografisk separasjon konkurrerer ioner av analytten med ioner inneholdt i elueringsmidlet, og har en tendens til å samhandle med motsatt ladede grupper i sorbenten. Det følger at ionebytterkromatografi kan brukes til å separere alle forbindelser som kan ioniseres på en eller annen måte. Det er mulig å analysere selv nøytrale sukkermolekyler i form av deres komplekser med borationer:

Sukker + VO 3 2 - = Sukker -VO 3 2 -.

Ionebytterkromatografi er uunnværlig for separering av høypolare stoffer, som ikke kan analyseres ved GLC uten omdannelse til derivater. Disse forbindelsene inkluderer aminosyrer, peptider og sukker.

Ionebytterkromatografi er mye brukt i medisin, biologi, biokjemi, for miljøovervåking, i analyse av innholdet av legemidler og deres metabolitter i blod og urin, plantevernmidler i matråvarer, samt for separasjon av uorganiske forbindelser, inkludert radioisotoper, lantanider, aktinider, etc. Analyse av biopolymerer (proteiner, nukleinsyrer, etc.), som vanligvis tok timer eller dager, ved hjelp av ionebytterkromatografi utføres på 20-40 minutter med bedre separasjon. Bruk av ionebytterkromatografi i biologi har gjort det mulig å observere prøver direkte i biologiske medier, noe som reduserer muligheten for omorganisering eller isomerisering, noe som kan føre til feil tolkning av det endelige resultatet. Det er interessant å bruke denne metoden til å overvåke endringer som skjer i biologiske væsker. Bruken av porøse svake anionbyttere basert på silikagel tillot separasjon av peptider. V

Ionebyttermekanismen kan representeres i form av følgende ligninger:

for anionbytte

X-+R+Y- h ->■ Y-+R+X-.

for kationbytte |

X+ + R-Y+ h=* Y++R-X+.

I det første tilfellet konkurrerer X~-prøveionet med mobilfase-ionet Y~ om R+-ionesentrene til ioneveksleren, og i det andre tilfellet konkurrerer X+-prøvekationene med Y+-ionene i mobilfasen om R-en. ~ ioniske sentre.

Naturligvis vil prøveioner som vekselvirker svakt med ioneveksleren holdes svakt tilbake på kolonnen under denne konkurransen og vil være de første som blir vasket ut fra den, og omvendt vil sterkere beholdte ioner være de siste som eluerer fra kolonnen . Vanligvis oppstår BTqpH4Hbie-interaksjoner av ikke-ionisk natur på grunn av adsorpsjon eller hydrogenbindinger av prøven med den ikke-ioniske delen av matrisen eller på grunn av den begrensede løseligheten til prøven i den mobile fasen. Det er vanskelig å isolere "klassisk" ionebytterkromatografi i sin "rene" form, og derfor går noen kromatografer ut fra empiriske snarere enn teoretiske prinsipper i ionebytterkromatografi.

Separasjonen av spesifikke stoffer avhenger først og fremst av valget av den mest egnede sorbenten og den mobile fasen. Ionebytterharpikser og silikageler med podede ionogene grupper brukes som stasjonære faser i ionebytterkromatografi.

2.4. SEKSJONSKROMATOGRAFI

Eksklusjonskromatografi er et alternativ! væskekromatografi, der separasjon skjer på grunn av fordeling av molekyler mellom løsningsmidlet som befinner seg inne i porene til sorbenten og løsningsmidlet som strømmer " mellom partiklene.

I motsetning til andre HPLC-alternativer, hvor separasjon kommer På grunn av de forskjellige interaksjonene mellom komponentene og overflaten av sorbenten, er rollen til det faste fyllstoffet i størrelseseksklusjonskromatografi kun å danne porer av en viss størrelse, og den stasjonære fasen er løsningsmidlet som fyller disse porene. Derfor er bruken av begrepet "sorbent" for disse fyllstoffene til en viss grad vilkårlig.

Et grunnleggende trekk ved metoden er evnen til å separere molekyler i henhold til deres størrelse i løsning i området nesten hvilken som helst molekylvekt - fra 10 2 til 10 8, noe som gjør det uunnværlig for studiet av syntetiske og biopolymerer.

Tradisjonelt kalles prosessen som utføres i organiske løsningsmidler fortsatt ofte gelpermeasjonskromatografi, og i vandige systemer - gelfiltreringskromatografi. I denne boken brukes et enkelt begrep for begge alternativene, som kommer fra det engelske "Size Exclusion" - ekskludering etter størrelse - og reflekterer mest fullstendig mekanismen i prosessen.

En detaljert analyse av eksisterende ideer om den svært komplekse teorien om størrelsesutføres i monografier.

Totalt volum løsemiddel i kolonnen Vt (dette kalles ofte det totale volumet av kolonnen, siden Vd ikke deltar i den kromatografiske prosessen) er summen av volumene til den mobile og stasjonære fasen.

Oppbevaringen av molekyler i en eksklusjonskolonne bestemmes av sannsynligheten for deres diffusjon inn i porene og avhenger av forholdet mellom størrelsene på molekyler og porer, som er vist skjematisk i fig. 2.15. Fordelingskoeffisient Ka, som i andre varianter av kromatografi, er det forholdet mellom konsentrasjonene av et stoff i den stasjonære og mobile fasen.

Siden den mobile og stasjonære fasen har samme sammensetning, da Kd et stoff der begge fasene er like tilgjengelige er lik enhet. Denne situasjonen er realisert for molekylene C med de minste størrelsene (inkludert løsemiddelmolekyler), som trenger inn i alle porene (se fig. 2.15) og derfor beveger seg langsomst gjennom kolonnen. Deres retensjonsvolum er lik det totale volumet av løsningsmidlet Vt-

Ris. 2.15. Modell av molekylær separasjon etter mål i størrelseseksklusjonskromatografi

Alle molekyler hvis størrelse er større enn størrelsen på sorbentporene kan ikke komme inn i dem (fullstendig ekskludering) og passere gjennom kanalene mellom partiklene. De eluerer fra kolonnen med samme retensjonsvolum lik volumet til mobilfasen V 0 - Fordelingskoeffisienten for disse molekylene er null.

Molekyler av middels størrelse, som er i stand til å penetrere bare noen av porene, holdes tilbake i kolonnen i henhold til deres størrelse. Fordelingskoeffisienten til disse molekylene varierer fra null til én og karakteriserer den brøkdelen av porevolumet som er tilgjengelig for molekyler av en gitt størrelse.Deres beholdte volum bestemmes av summen av V o og den tilgjengelige delen av porevolumet.

KVALITATIV ANALYSE

En kromatograf som går inn i feltet høyytelses væskekromatografi må bli kjent med det grunnleggende om kvalitativ analyse. Kvalitativ analyse brukes til å identifisere et kjent produkt, oppnådd på en ny måte eller funnet i en blanding med andre produkter." Det er nødvendig når du isolerer forskjellige komponenter fra komplekse biologiske og kjemiske blandinger, noe som er spesielt viktig innen medisin, rettsmedisin, økologi, for å overvåke tilstedeværelsen av noen medisinske kjemiske produkter og deres metabolitter i bioml.ter.ials.. "Kjenskap til det grunnleggende om kvalitativ" analyse vil bidra til å unngå vanlige feil, for eksempel ved å skille urenheter i en prøve fra urenheter i et løsemiddel eller kontrollere renheten til et stoff ved mer enn ett bølgelengdespektrofotometer, men på forskjellige osv.

Før man fortsetter med analysen, er det nødvendig å bestemme om hele prøven elueres fra kolonnen av et gitt løsningsmiddelsystem eller ikke. For å være sikker på fullstendig eluering er det nødvendig å samle opp all væske som strømmer fra kolonnen, fordampe løsningsmidlet, veie resten og finne graden av prøvegjenvinning.

Identifikasjon av komponenter i HPLC kan gjøres på tre måter: 1) ved hjelp av oppbevaringsinformasjon; 2) undersøke sonene oppnådd under separasjon i en væskekromatografkolonne ved bruk av spektrale eller kjemiske analysemetoder; 3) koble spektrumanalysatoren direkte til kolonnen.

Retensjonsvolum brukes til å registrere topper i kromatografi. V R eller oppbevaringstid t R. Begge mengdene er karakteristiske for et stoff i et gitt kromatografisystem. Siden retensjonstiden for stoffet som separeres består av interaksjonstiden i kolonnen og passeringstiden for de tomme delene av røret, varierer den fra instrument til instrument. Det er praktisk å ha et stoff som ikke holdes tilbake av en gitt kolonne, og tar det som en standard hvis retensjonstid og volum t 0 , V o. Kromatografi av stoffet og standarden skal utføres under samme forhold (trykk og strømningshastighet). Når identifisert av retensjonsdata, blir kjente individuelle stoffer som kan være tilstede i prøvene separert i samme kromatografiske system og verdier oppnås for dem t R. Sammenligner disse verdiene t R med retensjonstiden til den ukjente toppen, kan man finne at de enten faller sammen, i så fall er det sannsynlig at toppene tilsvarer det samme stoffet, eller t R kjent stoff samsvarer ikke t R ukjent sone. Da er et omtrentlig estimat av verdiene fortsatt mulig t R stoffer som ikke er tilgjengelige for direkte måling av retensjonsgraden. La oss vurdere begge alternativene.

I det første tilfellet er en foreløpig studie av prøven åpenbart nødvendig for å postulere tilstedeværelsen av spesifikke stoffer i den. Når du arbeider med enkle blandinger, er det ikke vanskelig å avgjøre om graden av retensjon av sonene til prøven og kjente stoffer sammenfaller eller ikke, dvs. verdiene tB samme eller forskjellige. Ved komplekse blandinger kan flere stoffer eluere med lignende verdier t R, og sonene som faktisk oppnås under kromatografisk separasjon overlapper hverandre. Som et resultat oppnår du nøyaktige verdier t R blir umulig for ulike soner. Pålitelighet for identifikasjon øker med økende oppløsning, mer nøye kontroll av separasjonsforhold og gjentatte målinger av verdier t R og gjennomsnitt av funnet verdier. I dette tilfellet må den kromatografiske separasjonen av kjente og ukjente stoffer veksle. Ved separering av komplekse blandinger, verdien t R stoffer kan endres under påvirkning av matrisen til selve prøven. Denne effekten er mulig i begynnelsen av kromatogrammet og når topper overlapper hverandre; Det er også mulig å stramme inn sonene, som allerede nevnt.

I slike tilfeller bør standarden tilsettes prøven i forholdet 1:1. Hvis stoffene er identiske, er verdien t R utgangsmaterialet endres ikke, og kun en topp oppnås i kromatogrammet. Hvis du har en enhet med et syklisk kromatografisystem, er det tilrådelig å føre blandingen gjennom kolonnen flere ganger for pålitelig identifikasjon.

Informasjon om retensjonsrater finnes også i litteraturen, men verdien av denne informasjonen er begrenset. Siden kolonner fra selv samme batch gir dårlig reproduserbarhet, samsvarer ikke alltid litteraturverdier med den sanne verdien t R på denne kolonnen. For adsorpsjonskromatografi er det imidlertid mulig å forutsi t R basert på litteraturdata. En annen vanskelighet knyttet til bruken av litterære betydninger t R, - vanskeligheten med å finne dem i den spesialiserte litteraturen, selv om bibliografiske oversikter publisert i Jornal of chromatography har en oppdatert indeks etter type stoff.

I det andre tilfellet, når retensjonstidene til kjente forbindelser og prøvesoner ikke sammenfaller, er det mulig å forutsi retensjonstiden for den ukjente komponenten. Forutsigelser om relativ retensjon basert på strukturdata i sterisk eksklusjonskromatografi er ganske pålitelige. De er mindre nøyaktige i adsorpsjons- og partisjonskromatografi, og spesielt når de arbeider på en kjemisk bundet fase. For ione- og ioneparkromatografi av stoffer med kjent s Ka Bare omtrentlige verdibestemmelser er mulig tR. Det er alltid lettere å forutsi relativ retensjon eller *x-verdier enn absolutte verdier k". Relative verdier t R lettere å vurdere for beslektede forbindelser eller derivater, for eksempel substituerte alkylkarboksylsyrer eller benzenderivater.

Når man isokratisk skiller homologer eller oligomerer, observeres følgende mønster noen ganger:

\ gk" = EN + Bn,

Hvor EN Og I- konstanter for et antall utvalgte prøver og for et gitt kromatografisystem (på samme kolonne, med samme mobile og stasjonære faser); P- antall identiske strukturelle enheter i prøvemolekylet.

Innføring av en funksjonell gruppe / inn i prøvemolekylet vil føre til en endring k" i den første ligningen med en eller annen konstant koeffisient a/ i et gitt kromatografisk system. Det er mulig å oppnå gruppekonstanter a/ for forskjellige substituentgrupper/, hvis verdier vil øke med økende polaritet av funksjonelle grupper i alle typer kromatografi, bortsett fra omvendt fase, hvor verdiene til konstantene vil avta med økende polaritet.

Noen gruppekonstanter a/ for ulike substituentgrupper/ er gitt i tabellen. 9.1.

I adsorpsjonskromatografi er ikke den første ligningen alltid aktuelt, siden den er gyldig forutsatt at alle isomerer har samme verdi k", som ikke alltid blir observert. Det er imidlertid mulig å plotte logfe" av de samme forbindelsene på en kolonne versus logfe" for de samme forbindelsene på en annen kolonne eller mot tilsvarende egenskaper i tynnsjiktskromatografi, for eksempel log[(l- Rf) IRf].

Kapasitetskoeffisientverdier kan brukes når man sammenligner oppbevaringsdata k", fordi i motsetning til ham t R hastigheten til den mobile fasen og de geometriske egenskapene til søylen påvirkes ikke.

Kjemisk bundne faseseparasjoner ligner pamed lignende faser, og derfor kan steady state ekstraksjonsdata brukes til å forutsi retensjonstider.

Ved ionebytterkromatografi påvirker tre faktorer retensjonsgraden: graden av ionisering av syrer og baser, ladningen til det ioniserte molekylet og evnen til stoffet fra den vandige mobile fasen som brukes i ionebytterkromatografi til å migrere inn i det organiske. fase. Sistnevnte avhenger av molekylvekten til forbindelsen og dens hydrofobitet. Derfor holdes sterkere syrer eller baser sterkere tilbake under anionbytte eller kationbytterseparasjon. Ved avtagende pK a av en individuell syre inkludert i prøven, øker retensjonen når en rekke syrer separeres på grunn av anionbytte, og med en økning i p/C o øker retensjonen av baser når de separeres på grunn av kationbytte.

Sammenfallet av retensjonstidene for et kjent stoff med det observerte gjør det derfor mulig å anta deres identitet. Påliteligheten til identifikasjon øker hvis kromatogrammene til et kjent stoff og en ukjent komponent sammenlignes under forskjellige forhold. Hvis stoffer oppfører seg identisk i adsorpsjon og omvendt fase eller ionebytte- og størrelseseksklusjonskromatografi, øker påliteligheten av identifiseringen. Hvis påliteligheten til identifikasjon med lik relativ oppbevaring er 90%, så når man studerer oppførselen til de samme stoffene under betydelig forskjellige forhold, er påliteligheten av identifiseringen allerede 99%.

En verdifull egenskap ved et stoff som brukes til identifisering er forholdet mellom signalene som oppnås for et gitt stoff på to forskjellige detektorer. Det analyserte stoffet, etter å ha forlatt kolonnen, passerer først gjennom den første detektoren, deretter gjennom den andre, og signalene som kommer fra detektorene registreres samtidig ved hjelp av en multipenn-opptaker eller på to opptakere. Vanligvis brukes en seriekobling av en ultrafiolett detektor (mer følsom, men selektiv) med et refraktometer, eller en ultrafiolett med en fluorescensdetektor, eller to ultrafiolette detektorer som opererer ved forskjellige bølgelengder. Den relative responsen, dvs. forholdet mellom refraktometersignalet og fotometersignalet, er en karakteristikk av stoffet, forutsatt at begge detektorene opererer i sitt lineære område; dette testes ved å administrere forskjellige mengder av samme stoff. Kvalitativ informasjon kan oppnås ved å arbeide med fotometriske detektorer utstyrt med en stoppstrømningsanordning som gjør det mulig å registrere spekteret til toppen som kommer ut fra kolonnen mens den er i strømningscellen, og sammenligne det med spekteret til en kjent forbindelse.

Moderne, fortsatt dyre, spektrofotometre med en diodegruppe er av betydelig interesse for identifikasjon.

Et helt ukjent stoff kan ikke identifiseres ved bruk av høyytelses væskekromatografi alene; andre metoder er også nødvendige.

KVANTITATIV ANALYSE

Kvantitativ væskekromatografi er en velutviklet analytisk metode som ikke er dårligere enn kvantitativ gasskromatografi og som overskrider nøyaktigheten til TLC eller elektroforese. som et katharometer i GLC) Derfor, for å oppnå kvantitative resultater, er kalibrering av enheten obligatorisk.

Kvantitativ analyse består av følgende trinn: 1) kromatografisk separasjon; 2) måling av toppområder eller høyder; 3) beregning av den kvantitative sammensetningen av blandingen basert på kromatografiske data; 4) tolkning av de oppnådde resultatene, dvs. statistisk prosessering. La oss vurdere alle disse stadiene.

4.1. KHRMATOGRAFISK SEPARASJON

Det kan oppstå feil under prøvetaking. Det er spesielt viktig å unngå feil og å få et tilstrekkelig representativt utvalg av heterogene faste stoffer, flyktige eller ustabile stoffer og landbruksprodukter og biomaterialer. Heterogene prøver, for eksempel matvarer, blandes grundig og deles i kvarte. Ved å utføre denne operasjonen mange ganger oppnås prøvehomogenitet.

Feil og tap av stoffer kan gjøres på stadiet av utvinning, isolering, rensing, etc.

Prøvene må være fullstendig oppløst og oppløsningene tilberedt med en nøyaktighet på ±0,1 %. Det er tilrådelig å oppløse prøven i den mobile fasen, noe som vil eliminere muligheten for utfelling etter innføring i kromatografen. Hvis oppløsning i den mobile fasen ikke er mulig, bør et løsemiddel som er blandbart med det brukes, og prøvevolumer (mindre enn 25 µl) bør introduseres i kromatografen.

Betydelige feil kan oppstå under prøveinjeksjon på grunn av prøvefraksjonering, lekkasje og topputsmøring. Sløringen av topper forårsaker dannelse av haler, noe som fører til delvis overlapping av topper og, som en konsekvens, til feil ved deteksjon. Sløyfeventilanordninger er å foretrekke fremfor sprøyter for prøveinnføring i kvantitativ analyse på grunn av høyere nøyaktighet og mindre operatøravhengighet.

Ved kromatografisk separering av stoffer kan det også oppstå komplikasjoner som fører til forvrengning av data: kvantitativ analyse. Det kan være dekomponering eller omdannelse av prøven under den kromatografiske prosessen eller irreversibel adsorpsjon av stoffet på kolonnen. Det er viktig å sikre fraværet av disse uønskede fenomenene og, om nødvendig, regenerere kolonnen eller erstatte den. Toppoverlapping og tailing kan også reduseres ved å variere kromatografiforholdene.

Topper med falske eller uklare former, samt topper hvis utgivelsestid er nær til, siden deres separasjon kanskje ikke er tilstrekkelig. Typisk brukes topper med en verdi d"^0,5. Den høyeste effektiviteten til kolonnen oppnås ved å tilføre 10~ 5 -10~ 6 g oppløst stoff per 1 g sorbent. Ved innføring av store mengder prøve vil avhengigheten av topphøyden på lasten kan vise seg å være ikke-lineær og det kreves en kvantitativ vurdering av toppområder.

Feil knyttet til deteksjon eller amplifikasjon fører til betydelig forvrengning av resultatene av kromatografisk separasjon. Hver detektor er preget av spesifisitet, linearitet og sensitivitet. Selektivitetstesting er spesielt viktig når man analyserer sporforurensninger. Responsen til UV-detektorer kan variere med en faktor på 104 på stoffer med lignende funksjonelle grupper. Det er nødvendig å kalibrere detektorresponsen for hver analytt. Naturligvis vil stoffer som ikke absorberer i UV-området ikke gi signal til opptakeren når de brukes som fotometerdetektor. Ved bruk av refraktometer kan negative topper vises. I tillegg skal denne detektoren være termostatisert, noe som ikke er nødvendig for UV-detektoren.

Lineariteten til detektoren bestemmer størrelsen på den injiserte prøven. Det er viktig å huske at kolonnestrømningshastighet, kolonne- og detektortemperaturer og detektordesign alle påvirker nøyaktigheten av den kvantitative analysen. Feil i overføringen av et elektrisk signal til en utgangsenhet (opptaker), integrator eller datamaskin kan oppstå på grunn av støyinduksjon, mangel på jording, spenningssvingninger i nettverket, etc.

4.2. MÅLING AV TOPPAREAL ELLER HØYDE

Topphøyde h (Fig. 10.1) er avstanden fra toppen av toppen til grunnlinjen, den måles lineært eller ved å telle antall delinger på en opptaker. Noen elektroniske integratorer og datamaskiner gir informasjon om topphøyder. Posisjonen til grunnlinjen til de forskjøvede toppene er funnet ved å interpolere ordinatverdiene som tilsvarer begynnelsen og slutten av toppen (topp 1 og 3 se fig. 10.1). For å forbedre nøyaktigheten er det nødvendig å ha en flat, stabil grunnlinje. Ved udelte topper trekkes grunnlinjen mellom starten og slutten av toppen i stedet for å erstattes av en nulllinje. Fordi topphøyder er mindre avhengig av påvirkningen av tilstøtende overlappende topper, er topphøydeestimering mer nøyaktig og brukes nesten alltid i sporsporanalyse.

Toppareal kan bestemmes på ulike måter. La oss se på noen av dem.

1. Den planimetriske metoden innebærer å spore toppen med et håndholdt planimeter, som er en enhet som mekanisk bestemmer toppens areal. Metoden er nøyaktig, men arbeidskrevende og dårlig reproduserbar. Denne metoden anbefales ikke.

2. Papirsilhuettmetode - toppen kuttes ut og veies. Metoden er svært reproduserbar, men arbeidskrevende, og kromatogrammet blir ødelagt. Dens anvendelighet avhenger av jevnheten til kartstripen. Metoden kan heller ikke anbefales bredt.

4. Trianguleringsmetoden består i å konstruere en trekant ved å tegne tangenter til sidene av toppen. Toppen av trekanten er høyere enn toppen av toppen. Å øke arealet som dannes av dette utvidede toppunktet vil være konsistent gjennom hele kromatogrammet og vil ikke påvirke nøyaktigheten i stor grad. I tillegg vil noe tapt areal ved tegning av tangenter bli kompensert. Trekantens basis bestemmes av skjæringspunktet mellom tangentene og grunnlinjen, og arealet bestemmes av produktet av 7 g av basen og høyden. Denne metoden er den beste for å bestemme områdene med asymmetriske topper. Imidlertid er reproduserbarheten når man konstruerer tangenter av forskjellige operatører forskjellig og derfor; lav.

5. Diskintegratormetoden er basert på en elektromekanisk enhet festet til en opptaker. Pennen festet til integratoren beveger seg langs en stripe nederst på båndet med en hastighet som er proporsjonal med bevegelsen til opptakeren.

Som med manuelle målinger, bør toppen forbli på registreringsskalaen, men justeringer for å kompensere for grunnlinjeskift og ufullstendig separasjon av tilstøtende topper reduserer påliteligheten og øker analysetiden.

Metoden er mer nøyaktig enn manuelle målemetoder, spesielt for asymmetriske topper, og gir en hastighetsfordel. I tillegg gir den en permanent kvantitativ registrering av analysen.

6. Metoder som bruker elektroniske integratorer som bestemmer toppareal og skriver ut informasjon om det området og retensjonstider kan inkludere og bestemme arealet til kun delvis adskilte topper. De viktigste fordelene er nøyaktighet, hastighet, handlingsuavhengighet fra opptakerens drift. Integratorer har minne og kan programmeres for en spesifikk analyse ved hjelp av et forhåndsinstallert program. Fordelene med integratoren inkluderer dens evne til å bruke korreksjonsfaktorer for detektorresponsen når de opprinnelige dataene om toppområder beregnes på nytt, og kompenserer for forskjeller i detektorens følsomhet overfor forskjellige stoffer. Slike systemer sparer tid, forbedrer analytisk nøyaktighet og er nyttige for rutinemessig analytisk analyse.

7. I væskekromatografi er datamaskiner mye brukt til å måle toppområder. De skriver ut en fullstendig melding, inkludert navnene på stoffene, toppområder, retensjonstider, deog overflod (vekt%) for de forskjellige prøvekomponentene.

Inneholder en prøveblanding gjennom en kolonne fylt med et fast adsorberende materiale. Hver komponent i prøven interagerer litt forskjellig med det adsorberende materialet, noe som resulterer i forskjellige strømningshastigheter for de forskjellige komponentene og forårsaker at komponentene skilles når de strømmer ut av kolonnen.

HPLC ble brukt til å lage ( For eksempel, i produksjonsprosessen av farmasøytiske og biologiske produkter), lovlig ( For eksempel, påvisning av ytelsesfremmende medikamenter i urin), studie ( For eksempel, skille komponentene i en kompleks biologisk prøve, eller lignende syntetiske kjemikalier fra hverandre), og medisinsk ( For eksempel, oppdage serum vitamin D-nivåer) mål.

Bruk av mer polare løsningsmidler i den mobile fasen vil redusere retensjonstiden til analyttene, mens mer hydrofobe løsningsmidler generelt vil forårsake langsommere elueringer (økte retensjonstider). Svært polare løsningsmidler, som spor av vann i den mobile fasen, har en tendens til å adsorbere på den faste overflaten av den stasjonære fasen, og danner et bundet (vann) immobilt lag, som antas å spille en aktiv rolle i konservering. Denne oppførselen er noe særegen for normalfasekromatografi, siden den nesten utelukkende kontrolleres av adsorpsjonsmekanismen ( de. analytter interagerer med en fast overflate, og ikke med et solvatisert lag av ligand festet til overflaten av sorbenten; se også omvendt fase HPLC nedenfor). Adsorpsjonskromatografi er fortsatt mye brukt for strukturelle isomerseparasjoner i både kolonne- og tynnsjiktskromatografiformater på en aktivert (tørket) silika- eller aluminiumoksydbærer.

Delings- og NP-HPLC falt i unåde på 1970-tallet med utviklingen av omvendt fase høyytelses væskekromatografi på grunn av dårlig retensjonstid reproduserbarhet på grunn av tilstedeværelsen av vann eller et protisk lag av organisk løsningsmiddel på overflaten av silika eller aluminiumoksyd kromatografiske medier. Dette laget endres med endringer i sammensetningen av den mobile fasen ( For eksempel, fuktighetsnivå) som forårsaker driftende retensjonstider.

Nylig har partisjonskromatografi blitt populært igjen med utviklingen av Hilic bundne faser, som viser forbedret reproduserbarhet, og på grunn av en bedre forståelse av rekkevidden av bruken av teknikken.

Kromatografivolum

Størrelseseksklusjonskromatografi

Størrelseseksklusjonskromatografi (SEC), også kjent som gelpermeasjonskromatografi eller gelfiltreringskromatografi, skiller partikler basert på molekylstørrelse (faktisk ved bruk av en Stokes radiuspartikkel). Dette er typisk en lavoppløsningskromatografi og er derfor ofte reservert for det siste polerings-, "rengjørings"-stadiet. Det er også nyttig for å bestemme den tertiære strukturen og den kvaternære strukturen til rensede proteiner. SEC brukes først og fremst til analyse av store molekyler som proteiner eller polymerer. SEC fungerer ved å fange disse mindre molekylene i porene til partikkelen. Større molekyler passerer ganske enkelt forbi porene da de er for store til å komme inn i porene. Derfor strømmer store molekyler gjennom kolonnen raskere enn mindre molekyler, det vil si at jo mindre molekylet er, desto lengre blir retensjonstiden.

Denne metoden er mye brukt for å bestemme molekylvekten til polysakkarider. SEC er den offisielle metoden (foreslått av European Pharmacopoeia) for molekylvektssammenligning av forskjellige kommersielt tilgjengelige lavmolekylære hepariner.

Ionebyttekromatografi

Ved ionebyttekromatografi (IC) er retensjon basert på tiltrekning mellom ioner i det oppløste stoffet og ladede objekter knyttet til den stasjonære fasen. Oppløste ioner med samme ladning som ladede steder på kolonnen er utelukket fra binding, mens oppløste ioner med motsatt ladning som ladede steder på kolonnen beholdes på kolonnen. Løsningsioner som holdes tilbake på kolonnen kan elueres fra kolonnen ved å endre løsningsmiddelforholdene ( For eksempel, øke den ioniske effekten av løsningsmiddelsystemet ved å øke saltkonsentrasjonen i løsningen, øke kolonnetemperaturen, endre pH i løsningsmidlet, etc.).

Typer ionebyttere inkluderer polystyrenharpikser, cellulose- og dekstranionbyttere (geler), samt kontrollert porøst glass eller porøs silika. Polystyrenharpikser tillater tverrbinding, noe som øker kjedestabiliteten. Høyere sidekohesjon reduserer folding, noe som øker likevektstiden og til slutt forbedrer selektiviteten. Cellulose- og dekstranionbyttere har store porestørrelser og lave ladningstettheter som gjør dem egnet for proteinseparasjon.

Generelt favoriserer ionebyttere bindende ioner med større ladning og mindre radius.

Smale søylehull (1-2 mm) brukes for applikasjoner hvor større følsomhet er ønsket enten gjennom dedikerte UV-VIS-detektorer, fluorescensdeteksjon eller gjennom andre deteksjonsmetoder, som for væskekromatografi-massespektrometri

Kapillærsøyler (opptil 0,3 mm) brukes nesten utelukkende med alternative deteksjonsmetoder, som massespektrometri. De er vanligvis laget av smeltede silikakapillærer i stedet for de rustfrie stålrørene som store søyler bruker.

Partikkelstørrelse

Mest tradisjonell HPLC utføres med en stasjonær fase festet til utsiden av små sfæriske kvartspartikler (svært små perler). Disse partiklene kommer i en rekke størrelser med 5 µm perler som de vanligste. Mindre partikler gir generelt mer overflateareal og mer separasjon, men trykket som kreves for å oppnå optimal lineær hastighetsøkning er det resiproke av partikkeldiameteren i kvadrat.

Dette betyr at å bytte til partikler som er dobbelt så store, og beholde kolonnestørrelsen den samme, vil doble produktiviteten, men øke det nødvendige trykket med en faktor på fire. Større partikler brukes i preparativ HPLC (5 cm til >30 cm diameter kolonne) og for ikke-HPLC-applikasjoner som fastfaseekstraksjon.

porestørrelse

Mange stasjonære faser er porøse for å gi et stort overflateareal. Små porer gir større overflateareal, mens større porestørrelser har bedre kinetikk, spesielt for større analytter. For eksempel kan et protein som bare er litt mindre enn porene komme inn i porene, men det er ikke lett å forlate når det først er inne.

pumpetrykk

GENERELL FARMAKOPOEIISK ARTIKKEL

I stedet for art. GF XI

Høyytelses væskekromatografi (høytrykks væskekromatografi) er en kolonnekromatografimetode der mobilfasen er en væske som beveger seg gjennom en kromatografikolonne fylt med en stasjonær fase (sorbent). Søyler for høyytelses væskekromatografi er preget av høy hydraulisk motstand ved innløpet.

Avhengig av mekanismen for separasjon av stoffer, skilles følgende varianter av høyytelses væskekromatografi: adsorpsjon, partisjon, ionebytte, eksklusjon, chiral, etc. i samsvar med arten av de viktigste intermolekylære interaksjonene som oppstår. Ved adsorpsjonskromatografi skjer separasjonen av stoffer på grunn av deres forskjellige evner til å bli adsorbert og desorbert fra overflaten av en sorbent med en utviklet overflate, for eksempel silikagel. Ved partisjons-høyytelses-væskekromatografi skjer separasjon på grunn av forskjellen i fordelingskoeffisienten til stoffene som separeres mellom den stasjonære fasen (vanligvis kjemisk podet til overflaten av en stasjonær bærer) og den mobile fasen.

Avhengig av typen mobil og stasjonær fase, skilles normal-fase og omvendt-fase kromatografi. I normalfase høyytelses væskekromatografi er den stasjonære fasen polar (oftest silikagel eller silikagel med podet NH 2- eller CN-grupper osv.), og mobilfasen er ikke-polar (heksan, eller blandinger av heksan) med mer polare organiske løsningsmidler - kloroform, alkoholer, etc.). Oppbevaringen av stoffer øker med økende polaritet. Ved normalfasekromatografi øker mobilfasens elueringsevne med økende polaritet.

I revers-fase kromatografi er den stasjonære fasen ikke-polar (hydrofobe silikageler med podede grupper C4, C8, C18, etc.); mobil fase – polar (blandinger av vann og polare løsningsmidler: acetonitril, metanol, tetrahydrofuran, etc.). Oppbevaringen av stoffer øker med økende hydrofobitet (ikke-polaritet). Jo høyere innhold av organisk løsningsmiddel, desto høyere er elueringsevnen til den mobile fasen.

I ionebytterkromatografi separeres molekylene til en blanding av stoffer, dissosiert i oppløsning til kationer og anioner, når de beveger seg gjennom en sorbent (kationbytter eller anionbytter) på grunn av forskjellig styrke i interaksjonen mellom de bestemte ionene og de ionegruppene. av sorbenten.

Ved størrelseseksklusjon (sil, gelpermeasjon, gelfiltrering) kromatografi separeres molekyler av stoffer etter størrelse på grunn av deres forskjellige evne til å trenge inn i porene i den stasjonære fasen. I dette tilfellet er de største molekylene som er i stand til å trenge inn i det minste antall porer i den stasjonære fasen de første som forlater kolonnen, og stoffer med små molekylstørrelser er de siste som forlater.

Kiral kromatografi separerer optisk aktive forbindelser i individuelle enantiomerer. Separasjonen kan utføres på kirale stasjonære faser eller på akirale stasjonære faser ved bruk av kirale mobile faser.

Det finnes andre alternativer for høyytelses væskekromatografi.

ofte skjer separasjon ikke av én, men av flere mekanismer samtidig, avhengig av typen mobile og stasjonære faser, samt arten av forbindelsen som bestemmes.

Bruksområde

Høyytelses væskekromatografi har blitt brukt til både kvalitativ og kvantitativ analyse av legemidler i testene "Identity", "Foreign Urities", "Oppløsning", "Doseuniformity", "Quantitative Deermination". Det skal bemerkes at kromatografi lar deg kombinere flere tester i en prøve, inkludert "Autentisitet" og "kvantitativ bestemmelse".

Utstyr

For å utføre analysen brukes passende instrumenter - væskekromatografer.

En væskekromatograf inkluderer vanligvis følgende hovedkomponenter:

— klargjøringsenhet for mobilfase, inkludert en beholder med mobilfase (eller beholdere med individuelle løsemidler inkludert i mobilfase) og et avgassingssystem for mobilfase;

— pumpesystem;

— mobilfasemikser (om nødvendig);

— prøveinnføringssystem (injektor), kan være manuelt eller automatisk (autosampler);

— kromatografisk kolonne (kan installeres i en termostat);

— detektor (en eller flere med forskjellige deteksjonsmetoder);

— kromatografkontrollsystem, datainnsamling og behandling.

I tillegg kan kromatografen inkludere: et prøveprepareringssystem og en pre-kolonnereaktor, et kolonnebyttesystem, en post-kolonnereaktor og annet utstyr.

Pumpesystem

Pumper leverer den mobile fasen til kolonnen med en gitt hastighet. Den mobile fasesammensetningen og strømningshastigheten kan være konstant eller varieres under analyse. I tilfelle av en konstant sammensetning av den mobile fasen, kalles prosessen isokratisk, og i den andre - gradient. Et moderne væskekromatografpumpesystem består av en eller flere datastyrte pumper. Dette lar deg endre sammensetningen av mobilfasen i henhold til et spesifikt program under gradienteluering. Pumper for analytisk høyytelses væskekromatografi lar deg opprettholde strømningshastigheten til den mobile fasen inn i kolonnen i området fra 0,1 til 10 ml/min ved et trykk ved innløpet til kolonnen opp til 40 MPa. Trykkpulsasjoner minimeres av spesielle spjeldsystemer som inngår i pumpenes design. Arbeidsdelene til pumpene er laget av korrosjonsbestandige materialer, som tillater bruk av aggressive komponenter i den mobile fasen.

Kraner

I blanderen dannes en enkelt mobil fase fra individuelle løsningsmidler levert av pumper, hvis den nødvendige blandingen ikke er forberedt på forhånd. Blanding av mobilfasekomponentene i blanderen kan skje både ved lavt trykk (før pumpene) og ved høyt trykk (etter pumpene). Blanderen kan brukes til klargjøring av mobilfase og isokratisk eluering.

Blandervolum kan påvirke retensjonstiden til komponentene under gradienteluering.

Injektorer

Injektorer kan være universelle, med muligheten til å endre volumet av den injiserte prøven, eller diskrete for å injisere bare et visst volum av prøven. Begge typer injektorer kan være automatiske ("autoinjektorer" eller "autosamplere"). Injektoren for innføring av prøven (løsningen) er plassert rett foran den kromatografiske kolonnen. Utformingen av injektoren lar deg endre strømningsretningen til den mobile fasen og utføre foreløpig innføring av prøven i en doseringssløyfe med et visst volum (vanligvis fra 10 til 100 μl) eller i en spesiell doseringsenhet med variabelt volum . Volumet av løkken er angitt på merkingen. Den diskrete injektordesignen tillater vanligvis utskifting av løkker. Moderne automatiske injektorer kan ha en rekke tilleggsfunksjoner, for eksempel utføre funksjonen til en prøveklargjøringsstasjon: bland og fortynne prøver, utfør en pre-kolonne derivatiseringsreaksjon.

Kromatografisk kolonne

Kromatografiske kolonner er vanligvis rør laget av rustfritt stål, glass eller plast, fylt med sorbent og lukket på begge sider med filtre med en porediameter på 2–5 µm. Lengden på den analytiske kolonnen kan være i området fra 5 til 60 cm eller mer, den indre diameteren kan være fra 2 til 10 mm. Kolonner med en indre diameter på mindre enn 2 mm brukes i mikrokolonnekromatografi. Det finnes også kapillærsøyler med en innvendig diameter på ca. 0,3–0,7 mm. Kolonner for preparativ kromatografi kan ha en innvendig diameter på 50 mm eller mer.

Korte søyler (pre-kolonner) kan installeres foran den analytiske kolonnen for å utføre ulike hjelpefunksjoner, hvorav den viktigste er å beskytte den analytiske kolonnen. Vanligvis utføres analyse ved romtemperatur, men for å øke separasjonseffektiviteten og redusere analysetiden kan kolonnetermostatering brukes ved temperaturer opp til 80 - 100 °C. Muligheten for å bruke forhøyede temperaturer under separasjon er begrenset av stabiliteten til den stasjonære fasen, siden dens ødeleggelse er mulig ved forhøyede temperaturer.

Stasjonær fase (sorbent)

Følgende brukes vanligvis som sorbenter:

silikagel, aluminiumoksid, brukt i normalfasekromatografi. Retensjonsmekanismen i dette tilfellet er vanligvis adsorpsjon;
silikagel, harpikser eller polymerer podet med sure eller basiske grupper. Bruksområde - ionebytte og ionekromatografi;
silikagel eller polymerer med en spesifisert porestørrelsesfordeling (størrelseseksklusjonskromatografi);
kjemisk modifiserte sorbenter (sorbenter med podede faser), oftest fremstilt på basis av silikagel. Retensjonsmekanismen er adsorpsjon eller fordeling mellom den mobile og stasjonære fasen. Anvendelsesomfanget avhenger av typen podede funksjonelle grupper. Noen typer sorbenter kan brukes i både revers- og normalfasekromatografi;
kjemisk modifiserte kirale sorbenter, for eksempel cellulose- og amylosederivater, proteiner og peptider, cyklodekstriner, kitosaner, brukt for separasjon av enantiomerer (kiral kromatografi).

Sorbenter med podede faser kan ha ulik grad av kjemisk modifikasjon. De mest brukte podede fasene er:

– oktadecylgrupper (sorberende oktadecylsilan (ODS) eller C 18);

– oktylgrupper (sorbent oktylsilan eller C 8);

– fenylgrupper (fenylsilan-sorbent);

– cyanopropylgrupper (CN-sorbent);

– aminopropylgrupper (NH 2 sorbent);

– diolgrupper (sorbentdiol).

Oftest utføres analysen på ikke-polare podede faser i omvendt fase ved bruk av en C 18 sorbent.

Sorbenter med podede faser oppnådd på basis av silikagel er kjemisk stabile ved pH-verdier fra 2,0 til 7,0, med mindre annet er spesifikt angitt av produsenten. Sorbentpartikler kan ha sfæriske eller uregelmessige former og variert porøsitet. Partikkelstørrelsen til sorbenten i analytisk høyytelses væskekromatografi er vanligvis 3–10 µm, i preparativ høyytelses væskekromatografi – 50 µm eller mer. Det finnes også monolittiske kolonner hvor sorbenten er en monolitt med gjennomgående porer som fyller hele kolonnens volum.

Høy separasjonseffektivitet sikres av det høye overflatearealet til sorbentpartikler (som er en konsekvens av deres mikroskopiske størrelse og tilstedeværelsen av porer), samt den jevne sammensetningen av sorbenten og dens tette og jevne pakking.

Detektorer

Høyytelses væskekromatografi bruker en rekke deteksjonsmetoder. I det generelle tilfellet kommer den mobile fasen med komponenter oppløst i den etter den kromatografiske kolonnen inn i detektorcellen, hvor en eller annen av dens egenskaper måles kontinuerlig (absorpsjon i det ultrafiolette eller synlige området av spekteret, fluorescens, brytningsindeks, elektrisk ledningsevne, etc.). Det resulterende kromatogrammet er en graf over avhengigheten av en fysisk eller fysisk-kjemisk parameter til den mobile fasen i tide.

De vanligste detektorene i høyytelses væskekromatografi er spektrofotometriske. Under eluering av stoffer måles den optiske tettheten til eluatet i en spesialdesignet mikrokyvette ved en forhåndsvalgt bølgelengde. Detektorens brede linearitetsområde gjør det mulig å analysere både urenheter og hovedkomponentene i blandingen i et enkelt kromatogram. En spektrofotometrisk detektor tillater deteksjon ved enhver bølgelengde i driftsområdet (vanligvis 190-600 nm). Multibølgedetektorer brukes også, som tillater deteksjon ved flere bølgelengder samtidig, og diodearraydetektorer, slik at optisk tetthet kan registreres samtidig over hele driftsbølgelengdeområdet (vanligvis 190-950 nm). Dette gjør det mulig å registrere absorpsjonsspektra for komponenter som passerer gjennom detektorcellen.

En fluorimetrisk detektor brukes til å bestemme fluorescerende forbindelser eller ikke-fluorescerende forbindelser i form av deres fluorescerende derivater. Driftsprinsippet til en fluorimetrisk detektor er basert på måling av fluorescerende emisjon av absorbert lys. Absorpsjon utføres vanligvis i det ultrafiolette området av spekteret, bølgelengdene til fluorescerende stråling overskrider bølgelengdene til absorbert lys. Fluorimetriske detektorer har svært høy følsomhet og selektivitet. Følsomheten til fluorescensdetektorer er omtrent 1000 ganger høyere enn følsomheten til spektrofotometriske. Moderne fluorescerende detektorer gjør det mulig ikke bare å oppnå kromatogrammer, men også å registrere eksitasjons- og fluorescensspektra til de analyserte forbindelsene.

For å bestemme forbindelser som absorberer svakt i de ultrafiolette og synlige områdene av spekteret (for eksempel karbohydrater), bruk refraktometrisk detektorer (refraktometre). Ulempene med disse detektorene er deres lave (sammenlignet med spektrofotometriske detektorer) følsomhet og betydelig temperaturavhengighet av signalintensiteten (detektoren må termostateres), samt umuligheten av å bruke dem i gradientelueringsmodus.

Prinsipp for operasjon fordampende laserlysspredningsdetektorer er basert på forskjellen i damptrykk til kromatografiske løsemidler som inngår i den mobile fasen og de analyserte stoffene. Den mobile fasen ved utløpet av kolonnen føres inn i forstøveren, blandes med nitrogen eller CO 2 og går i form av en fin aerosol inn i et oppvarmet fordampningsrør med en temperatur på 30–160 °C, hvor den mobile fase fordamper. En aerosol av ikke-flyktige partikler av de analyserte stoffene sprer lysstrømmen i dispersjonskammeret. Ut fra spredningsgraden av lysfluksen kan man bedømme mengden av forbindelsen som bestemmes. Detektoren er mer følsom enn en refraktometrisk; signalet avhenger ikke av de optiske egenskapene til prøven, av typen funksjonelle grupper i stoffene som bestemmes, av sammensetningen av den mobile fasen, og kan brukes i gradienten elueringsmodus.

Elektrokjemiske detektorer (konduktometriske, amperometriske, kulometriske, etc.). En amperometrisk detektor brukes til å oppdage elektroaktive forbindelser som kan oksideres eller reduseres på overflaten av en solid elektrode. Det analytiske signalet er størrelsen på oksidasjons- eller reduksjonsstrømmen. Detektorcellen har minst to elektroder - en arbeidselektrode og en referanseelektrode (sølvklorid eller stål). Et arbeidspotensial påføres elektrodene, hvis verdi avhenger av arten av forbindelsene som bestemmes. Målinger kan utføres både ved et konstant potensial og i en pulsert modus, når profilen for endringer i potensialet til arbeidselektroden settes i løpet av en syklus med signalopptak. En amperometrisk detektor bruker arbeidselektroder laget av karbonmaterialer (oftest glassaktig karbon eller grafitt) og metaller: platina, gull, kobber, nikkel.

En konduktometrisk detektor brukes til å oppdage anioner og kationer i ionekromatografi. Prinsippet for driften er basert på å måle den elektriske ledningsevnen til den mobile fasen under elueringen av stoffet.

En massespektrometrisk detektor, som har høy følsomhet og selektivitet, er ekstremt informativ. De nyeste modellene av væskekromatografi-massespektrometre opererer i m/z-masseområdet fra 20 til 4000 amu.

I høyytelses væskekromatografi brukes også Fourier-IR-detektorer, radioaktivitet og noen andre.

Datainnsamling og behandlingssystem

Et moderne databehandlingssystem er en personlig datamaskin koblet til en kromatograf med installert programvare som lar deg registrere og behandle et kromatogram, samt kontrollere driften av kromatografen og overvåke hovedparametrene til det kromatografiske systemet.

Mobil fase

Den mobile fasen i høyytelses væskekromatografi utfører en dobbel funksjon: den sikrer transport av desorberte molekyler langs kolonnen og regulerer likevektskonstantene, og følgelig retensjon som et resultat av interaksjon med den stasjonære fasen (sorbert på overflaten) og med at molekylene til stoffene separeres. Ved å endre sammensetningen av den mobile fasen i høyytelses væskekromatografi er det således mulig å påvirke retensjonstidene til forbindelser, selektiviteten og effektiviteten av deres separasjon.

Den mobile fasen kan bestå av ett løsemiddel, ofte to, og om nødvendig tre eller flere. Sammensetningen av den mobile fasen er angitt som volumforholdet mellom dens bestanddeler av løsemidler. I noen tilfeller kan masseforholdet være angitt, som må spesifikt oppgis. Bufferløsninger med en viss pH-verdi, ulike salter, syrer og baser og andre modifiseringsmidler kan brukes som komponenter i den mobile fasen.

Normalfasekromatografi bruker vanligvis flytende hydrokarboner (heksan, cykloheksan, heptan) og andre relativt ikke-polare løsningsmidler med små tilsetninger av polare organiske forbindelser som regulerer elueringskraften til den mobile fasen.

Ved omvendt fasekromatografi brukes vann eller vandig-organiske blandinger som mobil fase. Organiske tilsetningsstoffer er vanligvis polare organiske løsningsmidler (acetonitril og metanol). For å optimalisere separasjonen kan vandige løsninger med en viss pH-verdi brukes, spesielt bufferløsninger, samt ulike tilsetningsstoffer til den mobile fasen: fosforsyre og eddiksyre ved separering av sure forbindelser; ammoniakk og alifatiske aminer ved separering av basiske forbindelser, og andre modifiseringsmidler.

Den kromatografiske analysen er sterkt påvirket av renheten til den mobile fasen, så det er å foretrekke å bruke løsemidler produsert spesielt for væskekromatografi (inkludert vann).

Når du bruker en UV-spektrofotometrisk detektor, skal den mobile fasen ikke ha betydelig absorpsjon ved bølgelengden som er valgt for deteksjon. Gjennomsiktighetsgrensen eller optisk tetthet ved en viss bølgelengde for en bestemt løsningsmiddelprodusent er ofte angitt på emballasjen.

Den mobile fasen og analyserte løsninger skal ikke inneholde uoppløste partikler og gassbobler. Vann oppnådd i laboratorieforhold, vandige løsninger, organiske løsningsmidler forhåndsblandet med vann, samt analyserte løsninger må finfiltreres og avgassing. For disse formålene brukes vanligvis vakuumfiltrering gjennom et membranfilter med en porestørrelse på 0,45 μm, inert i forhold til et gitt løsemiddel eller løsning.

Liste over kromatografiske forhold som skal spesifiseres

Farmakopémonografien må inneholde: det fullstendige kommersielle navnet på kolonnen som angir produsent og katalognummer, dimensjonene til kolonnen (lengde og indre diameter), typen sorbent som angir partikkelstørrelse, porestørrelse, kolonnetemperatur (hvis termostatering er nødvendig), volumet av den injiserte prøven (volumsløyfer), sammensetningen av den mobile fasen og fremgangsmåten for dens tilberedning, matehastigheten til den mobile fasen, type detektor og deteksjonsforhold (om nødvendig, parametere for detektorcellen som brukes), beskrivelse av gradientmodus (hvis brukt), inkludert stadiet for re-ekvilibrering til startforholdene, kromatografitid, detaljert beskrivelse av beregningsmetoden og formelen, beskrivelse av fremstillingen av standard- og testløsninger.

Hvis pre-kolonne derivatisering brukes i en autosampler, gis informasjon om autosampler programmet. Hvis post-kolonne derivatisering brukes, angis matehastigheten til derivatiseringsreagenset, volumet av blandesløyfen og dens temperatur.

Modifiserte typer høyytelses væskekromatografi

Ioneparkromatografi

En av variantene av revers-fase høyytelses væskekromatografi er ioneparkromatografi, som tillater bestemmelse av ioniserte forbindelser. For å gjøre dette tilsettes hydrofobe organiske forbindelser med ioniske grupper (ioneparreagenser) til den tradisjonelle omvendte fase høyytelses væskekromatografi mobile fase. Natriumalkylsulfater brukes vanligvis til å skille baser; tetraalkylammoniumsalter (tetrabutylammoniumfosfat, cetyltrimetylammoniumbromid, etc.) brukes til å skille syrer. I ioneparmodus vil selektiviteten til separasjonen av ikke-ioniske komponenter begrenses av reversfaseretensjonsmekanismen, og retensjonen av baser og syrer vil øke markant, mens formen på de kromatografiske toppene vil forbedres.

Retensjon i ioneparmodus skyldes ganske komplekse likevektsprosesser som konkurrerer med hverandre. På den ene siden, på grunn av hydrofobe interaksjoner og effekten av forskyvning av det polare miljøet til den mobile fasen, er sorpsjonen av hydrofobe ioner på overflaten av alkylsilikagel mulig på en slik måte at de ladede gruppene vender mot den mobile fasen. I dette tilfellet får overflaten ionebytteegenskaper, og retensjon følger lovene for ionebytterkromatografi. På den annen side er det mulig å danne et ionepar direkte i volumet av elueringsmidlet, etterfulgt av dets sorpsjon på sorbenten i henhold til revers-fase-mekanismen.

Hydrofil interaksjonskromatografi ( HILISK kromatografi)

Hydrofil interaksjonskromatografi brukes til å skille polare forbindelser som er svakt beholdt i omvendt fase høyytelses væskekromatografi. I denne versjonen av kromatografi brukes vann-acetonitrilblandinger med tilsetning av salter, syrer eller baser som mobil fase. Stasjonære faser er som regel silikageler modifisert med polare grupper (amino-, diol-, cyanopropylgrupper, etc.). Flere polare forbindelser holdes sterkere. Elueringsevnen til den mobile fasen øker med økende polaritet.

Ionebytte og høyytelses væskekromatografi

Ionebytterkromatografi brukes til analyse av både organiske (heterosykliske baser, aminosyrer, proteiner, etc.) og uorganiske (ulike kationer og anioner) forbindelser. Separasjonen av komponentene i den analyserte blandingen i ionebytterkromatografi er basert på den reversible interaksjonen mellom ionene til de analyserte stoffene og ionebyttergruppene i sorbenten. Disse sorbentene er hovedsakelig enten polymerionebytterharpikser (vanligvis kopolymerer av styren og divinylbenzen med podede ionebyttergrupper) eller silikageler med podede ionebyttergrupper. Sorbenter med grupper: -NH 3 +, -R 3 N +, -R 2 HN +, -RH 2 N + osv. brukes til å skille anioner (anionbyttere), og sorbenter med grupper: -SO 3 –, - RSO 3 – , –COOH, -PO 3 – og andre for separering av kationer (kationbyttere).

Vandige løsninger av syrer, baser og salter brukes som en mobil fase i ionebytterkromatografi. Vanligvis brukes bufferløsninger for å opprettholde visse pH-verdier. Det er også mulig å bruke små tilsetninger av vannblandbare organiske løsningsmidler - acetonitril, metanol, etanol, tetrahydrofuran.

Ionekromatografi – en variant av ionebytterkromatografi, der en konduktometrisk detektor brukes til å detektere forbindelsene (ionene) som bestemmes. For svært sensitiv bestemmelse av endringer i den elektriske ledningsevnen til den mobile fasen som passerer gjennom detektoren, må den elektriske bakgrunnsledningsevnen til den mobile fasen være lav.

Det er to hovedvarianter av ionekromatografi.

Den første av dem, to-kolonne ionekromatografi, er basert på undertrykkelse av den elektriske ledningsevnen til mobilfaseelektrolytten ved å bruke en andre ionebytterkolonne eller et spesielt membranundertrykkelsessystem plassert mellom analytisk kolonne og detektoren. Når den passerer gjennom systemet, reduseres den elektriske ledningsevnen til mobilfasen.

Den andre varianten av ionekromatografi er en-kolonne ionekromatografi. Dette alternativet bruker en mobil fase med svært lav elektrisk ledningsevne. Svake organiske syrer er mye brukt som elektrolytter: benzosyre, salisylsyre eller isoftalsyre.

Størrelsesekskludering høyytelses væskekromatografi

Størrelseseksklusjonskromatografi (gelkromatografi) er en spesiell versjon av høyytelses væskekromatografi basert på separasjon av molekyler etter deres størrelse. Fordelingen av molekyler mellom den stasjonære og mobile fasen er basert på størrelsen på molekylene og delvis på deres form og polaritet.

To begrensende typer interaksjon av molekyler med en porøs stasjonær fase er mulig. Molekyler større enn den maksimale porediameteren beholdes ikke i det hele tatt og eluerer først og beveger seg samtidig med den mobile fasen. Molekyler med størrelser mindre enn minste porediameter til sorbenten trenger fritt inn i porene og er de siste som elueres fra kolonnen. De gjenværende molekylene, som har mellomstørrelser, holdes delvis tilbake i porene og deles under eluering i fraksjoner i samsvar med størrelsen og trenger delvis inn i porene til sorbenten avhengig av størrelsen og delvis avhengig av formen. Som et resultat eluerer stoffer med forskjellige retensjonstider.

Ioneeksklusjonskromatografi

Mekanismen for ioneeksklusjonskromatografi er basert på effekten som et resultat av at forbindelser i ionisert form ikke holdes tilbake på ionebyttersorbenten, mens forbindelser i molekylær form fordeles mellom de stasjonære og vandige fasene inne i porene til ionebyttersorbenten. og den mobile fasen migrerer i rommet mellom sorbentpartiklene. Separasjon er basert på elektrostatisk frastøtning, polare og hydrofobe interaksjoner mellom oppløste forbindelser og sorbenten.

Anioniske grupper på overflaten av sorbenten fungerer som en semipermeabel "membran" mellom den stasjonære og mobile fasen. Negativt ladede komponenter når ikke den stasjonære mobile fasen, siden de frastøtes av lignende ladede funksjonelle grupper og eluerer i det "døde" (frie) volumet av kolonnen. Komponentene i molekylær form blir ikke "avvist" av kationbyttersorbenten og fordeles mellom den stasjonære og mobile fasen. Forskjellen i retensjonsgraden av ikke-ioniske komponenter i blandingen er diktert av en kombinasjon av polare interaksjoner av ikke-ioniske komponenter med de funksjonelle gruppene til kationbytter-sorbenten og hydrofobe interaksjoner av ikke-ioniske komponenter med den ikke-polare sorbentmatrisen.

Kiral kromatografi

Målet med kiral kromatografi er separasjon av optiske isomerer. Separasjoner utføres på kirale stasjonære faser eller på konvensjonelle akirale stasjonære faser ved bruk av kirale mobile faser. Som kirale stasjonære faser brukes sorbenter med modifisert overflate, grupper eller stoffer som har kirale sentre (kitosaner, cyklodekstriner, polysakkarider, proteiner, etc. (kirale selektorer). I dette tilfellet brukes de samme fasene som i normalfase eller revers-. fasekromatografi. Ved bruk av akirale stasjonære faser, for å sikre separasjon av enantiomerer, vil kirale modifikatorer tilsettes de mobile fasene: kirale metallkomplekser, nøytrale kirale ligander, kirale ioneparreagenser, etc.

Ultraytelses væskekromatografi

Ultraperformance væskekromatografi er en variant av væskekromatografi som er mer effektiv enn klassisk høyytelses væskekromatografi.

Et trekk ved ultraytende væskekromatografi er bruken av sorbenter med partikkelstørrelser fra 1,5 til 2 mikron. Kromatografikolonnestørrelser varierer vanligvis fra 50 til 150 mm i lengde og 1 til 4 mm i diameter. Volumet av den injiserte prøven kan variere fra 1 til 50 µl. Bruken av slike kromatografiske kolonner kan redusere analysetiden betydelig og øke effektiviteten av kromatografisk separasjon. Men i dette tilfellet kan trykket på kolonnen nå 80–120 MPa, den nødvendige frekvensen for detektordatainnsamling kan øke til 40–100 hertz, og ekstrakolonnevolumet til det kromatografiske systemet må minimeres. Kromatografiutstyret og kolonnene som brukes i ultra-ytelses væskekromatografi er spesielt tilpasset for å møte kravene til denne typen kromatografi.

Utstyr designet for ultraytende væskekromatografi kan også brukes i den klassiske versjonen av høyytelses væskekromatografi.