hjem » Til direktøren, rektor

Fastfasesyntese av peptider. Fastfasesyntese. Reaksjoner for dannelse av peptidbindinger

For at aminosyrer skal gå sammen i riktig rekkefølge, er det nødvendig å beskytte aminogruppen i den ene komponenten og karboksylgruppen i den andre. Oftest brukes benzyloksykarbonyl- og tert-butyloksykarbonylgrupper for å beskytte aminogrupper, siden dette i de fleste tilfeller fører til en reduksjon i racemisering ved nærliggende sentre.

Sure grupper beskyttes ofte ved omdannelse til benzylestere. Ved fastfasesyntese er aminosyren bundet til polymeren i form av en substituert benzylester.

Andre funksjonsgrupper kan også kreve beskyttelse. Spesielt nitreres guanidylgruppen, og hydroksylgruppene omdannes til benzyletere.

Benzylgrupper fjernes fra produktet ved virkning i trifluoreddiksyre, og nitrogrupper fjernes ved katalytisk hydrogenering, som vist nedenfor i sluttfasen av fastfasesyntesen av bradykinin:

14.7.2.2. Reaksjoner for dannelse av peptidbindinger

Reaksjonene inkludert i denne gruppen er prosessene med å binde aminogruppen til en aminosyre med karboksylgruppen til en annen aminosyre for å danne et amid (eller peptid). Amider fremstilles vanligvis ved å reagere et amin med et syreklorid, ester eller anhydrid. De to siste alternativene brukes oftest, siden bruk av et syreklorid fører til økt racemisering av aminosyren.

Racemisering under dannelse av peptidbindinger skjer på grunn av dannelsen av oksazolon (70), som racemiserer lett som vist nedenfor:

Hastigheten av racemisering avhenger av arten av gruppene; den kan enten være en beskyttende gruppe for frie aminogrupper [i dette tilfellet kan racemisering reduseres hvis det er en rest av peptidkjeden. I sistnevnte tilfelle kan nesten ingenting gjøres for å endre graden av racemisering. - er en radikal av aminosyren som brukes og kan derfor ikke modifiseres. X er gruppen som brukes til å aktivere syren, og det er derfor det er gjort mye forskning for å finne den beste måten å aktivere karboksylgruppen på med lav grad av racemisering. La oss nå vurdere flere av de mest brukte metodene for aktivering av karboksylgruppen.

Azidmetoden. Reaksjonssekvensen som utgjør metoden er gitt nedenfor:

Hovedfordelen med denne metoden er en liten racemisering, men den har også to betydelige ulemper: for det første et ganske stort antall stadier, og for det andre muligheten for omorganisering av azid (72) til isocyanat (73), som fører til en ureaderivat (74), som er vanskelig å skille fra peptidet:

Denne metoden brukes ofte i blokksyntese, når det ikke er mulig å koble blokker gjennom glycin- eller prolinfragmenter (avsnitt 14.7.3),

Dicykloheksylkarbodiimid Denne metoden innebærer å konvertere karboksylgruppen til en aktivert ester type 75:

Fordelene med denne metoden er følgende: gode utbytter med korte reaksjonstider og lav grad av racemisering i tilfelle når eller. Samtidig er det ulemper: for det første racemisering hvis resten er en aminosyre; for det andre kontaminering av produktet med en urenhet av dicykloheksylurea (76), som er vanskelig å separere, og for det tredje reaksjonen av den aktiverte esteren (75) med en -beskyttet aminosyre for å danne et anhydrid (77), som også kan bare skilles fra peptidet med vanskeligheter:

Dicykloheksylkarbodiimid er et kondenseringsmiddel som oftest brukes i fastfasesyntese (avsnitt 14.7.2.3).

I DHC-metoden er det mulig å bruke tilsetningsstoffer som reduserer racemisering. Spesielt mye brukt som tilsetningsstoffer er -hydroksybenzotriazol (79), -hydroksysuccinimid (78) og De reagerer lett med aktivert ester (75) for å danne svært aktive mellomprodukter, for eksempel som

reagere med en beskyttet aminosyre før betydelig racemisering skjer:

Aktivert estermetode. Hvis en karboksylgruppe lett kan omdannes til en estergruppe som lett kan samhandle med en fri aminogruppe, så skjer dannelsen av en peptidbinding under milde forhold og med høye utbytter. Mange etere ble undersøkt, inkludert -nitrofenyl og tiofenyl, men pentaklorfenyleter viste seg å være den mest praktiske.

Pentaklorfenylestere er blant de mest aktive; de tilsvarende aminosyreesterne er som regel karakterisert ved høyere smeltetemperaturer enn andre representanter for aktiverte estere. I tillegg, i motsetning til a-nitrofenyl- og tiofenyletere, er de motstandsdyktige mot katalytisk hydrogenering og kan derfor brukes i tilfeller der selektiv fjerning, for eksempel, av benzyloksykarbonylgrupper ved katalytisk hydrogenering utføres:

Racemisering er spesielt lav: det antas at dette er et resultat av de steriske kravene til kloratomene i posisjon 2 og 6, som forhindrer dannelsen av oksazolon.

Pentaklorfenyletere kan fremstilles fra aminosyrer enten ved reaksjon med pentaklorfenol i nærvær av dicykloheksylkarbodiimid, eller ved reaksjon med pentaklorfenyltrikloracetat i nærvær av trietylamin:

14.7.2.3. Fastfasesyntese av peptider

Et av de viktige fremskrittene innen peptidsyntese ble oppnådd i 1962, da Merrifield først beskrev syntesen av et tetrapeptid ved bruk av fastfasemetoden, som siden ofte har blitt assosiert med navnet hans. Denne metoden består av følgende stadier:

1. Tilsetning av en -beskyttet aminosyre til en kopolymer av styren med divinylbenzen, hvor 5 % av dens fenylgrupper er klormetylert (82):

Det skal bemerkes at - dette er en substituert benzylester, derfor, i løpet av dette stadiet, festes ikke bare aminogruppen til kopolymeren, men også karboksylgruppen er beskyttet.

2. Fjerning av -beskyttelsesgruppen (trinn A).

3. Reaksjon av en fri aminogruppe med en -beskyttet aminosyre, oftest som et kondenseringsmiddel (med eller uten tilsetningsstoffer) (trinn B):

4. Gjenta trinnene med -beskyttede aminosyrer til alle spesifiserte aminosyrer er bundet.

5. Fjerning av det beskyttede peptidet fra polymeren; Trifluoreddiksyre brukes oftest til dette formålet. Dette reagenset fjerner også andre beskyttelsesgrupper, inkludert -benzyloksykarbonyl, -butylokokarbonyl og O-benzyl.

6. Fjerning av andre beskyttelsesgrupper.

Det er kanskje ikke fordelaktig å syntetisere et peptid som inneholder mer enn 15 aminosyreenheter på denne måten, men ribonuklease, som består av 124 aminosyreenheter, har blitt syntetisert utelukkende ved bruk av fastfasereaksjoner ved bruk av blokkeringsmetoden (avsnitt 14.7.1) .

Fordeler med metoden: 1) reaksjoner skjer raskt med høye utbytter; 2) nesten ingen racemisering forekommer (eller den er veldig liten) hvis tert-butyl eller benzyloksykarbonyl, siden reaksjonen skjer ved den -beskyttede aminosyren; 3) rensing av intermediære forbindelser er ikke annet enn å vaske polymeren fra ikke-polymere reagenser hvis reaksjonen er fullført; 4) metoden kan automatiseres (nonapeptidsyntese kan utføres på ca

Metodens begrensninger: 1) ufullstendig tilsetning av den C-terminale aminosyren til benzylgruppene i polymeren kan føre til dannelse av urenheter, for eksempel under syntesen av et pentapeptid kan en kjede dannes når den andre aminoen syre reagerer med benzylgruppen som er igjen i det første trinnet. Denne reaksjonen konkurrerer med den ufullstendige tilsetningen av den beskyttede aminosyren til den frie aminogruppen (et trinn som kan føre til dannelse av forkortede peptider (for eksempel og feil sekvenser (for eksempel mangelen på analytiske metoder for å bestemme urenheter som kan brukes uten å skille peptidet fra polymeren.En slik bestemmelse kan være svært bortkastet, tidkrevende og i seg selv føre til produktnedbrytning.

14.7.3. Syntese av et peptid med høy molekylvekt - grunnleggende trypsinhemmer (BTI) fra bovin bukspyttkjertel

Dette peptidet, bestående av 58 aminosyreenheter (molekylvekt 6500), ble funnet å ha sekvensen av aminosyreenheter gitt på side 336.

Syntesen av dette peptidet, beskrevet i en rekke artikler, illustrerer strategien som brukes i slike tilfeller.

Metoden bruker forhåndssyntetiserte

blokker, som deretter kobles sammen via glycin-deler (angitt med fet skrift ved 84) for å eliminere problemet med racemisering i de siste trinnene. De syntetiserte peptidene (1-12), (13-28), 29-56 og (57-58) ble koblet til hverandre ved en fastfasemetode.

Den -metoksybenzyloksy-beskyttende kjede ble festet til

brommetylert kopolymer av styren med divinylbenzen. Hver peptidblokk og (1-12)] ble festet til den voksende peptidkjeden, mens dicykloheksylkarbodiimid (DCHC med tillegg av N-hydroksysuksinimid (HSI) ble brukt som kondenseringsmiddel. Det aktive peptidet ble separert fra polymeren, den beskyttende grupper ble fjernet av Alt dette kan skrives i form av et diagram (se side 336; TFA - trifluoreddiksyre).

Det totale utbyttet av produkt 85 var ca. 40 %, hvorfra kun 10 % av det rensede aktive 84 kunne oppnås.

Blokkene ble syntetisert ved å koble fragmenter oppnådd ved enten lineær eller konvergent syntese. Ved konstruksjon av blokk (1-12) ble fragmentene koblet via prolinenheter, siden racemisering er minimal i dette tilfellet. I de fleste tilfeller ble koblingen utført ved den aktiverte estermetoden ved bruk av pentaklorfenyl (PCP) eller -nitrofenylestere. Synteseskjemaet for den benzyloksykarbonylbeskyttede blokken er gitt nedenfor.

I tilfeller hvor prolinenheter ikke kan brukes som et bindingssted for fragmenter, utføres koblingen ved hjelp av azidmetoden, som innebærer mindre racemisering.

Den totale aktiviteten til produktet (80%) er høyere enn ved trinnvis syntese ifølge Merrifield (30%).


Utdannings- og vitenskapsdepartementet i Den russiske føderasjonen

Federal State Autonomous Educational Institution of Higher Professional Education "Ural Federal University oppkalt etter Russlands første president B. N. Jeltsin"

Institutt for organisk synteseteknologi

Abstrakt om emnet: "Prinsipler og metoder for fastfasesyntese. Peptidsyntese »

Fullført av student gr. X-300803

Shaikhutdinova A.I.

Jeg sjekket V.S. Berseneva.

Jekaterinburg 2013

1. Introduksjon………………………………………………………………………………………3

2. Hva er peptider?................................................ ................................................................... 4

2.1. Struktur av peptider……………………………………………………………….5

2.2. Peptidsyntese……………………………………………………………….7

3. Fastfasesyntese av peptider………………………………………………………………………10

3.1. Merrinfield-metoden …………………………………………………………………10

3.2. Solid støtte……………………………………………………………….14

3.3. Velge et underlag………………………………………………………………...14

3.4. Linkere……………………………………………………………………………………………….16

4. Den første syntesen av det naturlige hormonet – oksytocin……………………….22

5. Syntese av insulin i cellen…………………………………………………..30

6. Konklusjon………………………………………………………………………………………………..34

7. Litteratur…………………………………………………………………………………...35

Introduksjon

I organisk kjemi er det ikke en eneste reaksjon som i praksis gir kvantitative utbytter av målproduktene i alle fall. Det eneste unntaket er tilsynelatende fullstendig forbrenning av organiske stoffer i oksygen ved høye temperaturer til CO 2 og H 2 O. Derfor er rensing av målproduktet en kompleks og tidkrevende oppgave. For eksempel er 100 % rensing av peptidsynteseprodukter et vanskelig problem. Faktisk ble den første komplette syntesen av et peptid, hormonet oksytocin (1953), som bare inneholdt 8 aminosyrerester, ansett som en enestående prestasjon som ga forfatteren V. du Vigneault Nobelprisen i 1955. Men i den neste tjue år ble syntesen av polypeptider med lignende kompleksitet til rutine, slik at syntesen av polypeptider bestående av 100 eller flere aminosyrerester i dag ikke lenger anses som en uoverkommelig vanskelig oppgave.

Formålet med arbeidet: å analysere og forklare: "Hva forårsaket slike dramatiske endringer innen polypeptidsyntese?"

Hva er peptider?

Peptider er naturlige eller syntetiske forbindelser,molekylersom er bygget av restenealfa-aminosyrer koblet sammen av peptid (amid) bindinger C(O)NH. Kan inneholdemolekylogså en ikke-aminosyrekomponent (for eksempel restenkarbohydrater). I henhold til antall aminosyrerester inkludert imolekyler peptider, det er dipeptider, tripeptider, tetrapeptider, etc. Peptider som inneholder opptil 10 aminosyrerester kalles oligopeptider, som inneholder mer enn 10 aminosyrerester polypeptider Naturlig polypeptidermed en molekylvekt på mer enn 6 tusen kallesproteiner.

For første gang ble peptider isolert fra enzymatiske proteinhydrolysater. Begrepet "peptider" ble foreslått av E. Fischer. Det første syntetiske peptidet ble oppnådd av T. Curtius i 1881. I 1905 utviklet E. Fischer den første generelle metoden for syntese av peptider og syntetiserte en rekke oligopeptider med forskjellige strukturer. De eksisterende bidragene til utviklingen av peptidkjemi ble gitt av E. Fischers studenter E. Abdergalden, G. Leike og M. Bergman. I 1932 brukte M. Bergman og L. Zer en benzyloksykarbonylgruppe (karbobenzoksygruppe) i syntesen av peptider for å beskytte alfa-aminogruppene til aminosyrer, noe som markerte et nytt stadium i utviklingen av peptidsyntese. De resulterende N-beskyttede aminosyrene (N-karbobenzoksyaminosyrer) ble mye brukt for å oppnå forskjellige peptider, som med suksess ble brukt til å studere en rekke nøkkelproblemer i kjemien og biokjemien til disse stoffene, for eksempel for å studere substratspesifisiteten til proteolytiske enzymer. Ved å bruke N-karbobenzoksyaminosyrer ble naturlige peptider (glutation, karnosin, etc.) syntetisert for første gang. En viktig prestasjon på dette området utviklet seg på begynnelsen av 50-tallet. P. Vaughan et al. syntese av peptider ved den blandede anhydridmetoden.

I 1953 syntetiserte V. Du Vigneault det første peptidhormonet, oksytocin. Basert på konseptet med fastfase peptidsyntese utviklet av P. Merrifield i 1963, ble automatiske peptidsyntesemaskiner laget. Metoder for kontrollert enzymatisk syntese av peptider har fått intensiv utvikling. Bruk av nye metoder gjorde det mulig å syntetisere hormonet insulin mv.

Suksessen med syntetisk kjemi av peptider ble utarbeidet av fremskritt i utviklingen av slike metoder for separasjon, rensing og analyse av peptider som ionebytterkromatografi, elektroforese på forskjellige bærere, gelfiltrering, høyytelses væskekromatografi (HPLC), immunkjemisk analyse, etc. De mottok også gode utviklingsmetoder for sluttgruppeanalyse og trinnvise peptidfordøyelsesmetoder. Spesielt ble det laget automatiske aminosyreanalysatorer og automatiske enheter for å bestemme primærstrukturen til peptider, såkalte sekvensere.

Bruk: i peptidkjemi ved syntese av peptidkjeder som inneholder histidin og serin. Essensen av oppfinnelsen: en fremgangsmåte for fastfasesyntese av peptider av generell type 1, inkludert tilsetning av N-beskyttede terminale aminosyrer til en inert fast bærer, den påfølgende tilsetningen av N-beskyttede aminosyrer til det utvidede peptidet kjeden, og sidekjeden til serinresten er midlertidig beskyttet av en gruppe som er labil for midlene, brukt til å fjerne alfa-amino-beskyttende grupper, og histidin-sidekjeden, hvis den er tilstede, er beskyttet med en gruppe labil for alfa-aminoen. avbeskyttelsesmiddel; fjerning av beskyttelsesgruppen ved slutten av hver syklus, spaltning av polypeptidet fra bæreren ved bruk av aminolyse eller ammonolyse, isolering av den resulterende forbindelse I. Form I: R 1 -R 2 -R 3 -Ser-Tyr-R 4 - heu-R5-Pro-R6, hvor R1-pyro-Glu, N-AcDNal; R2His, DpClPhe, DpFPho, R3 = Tgr, D-Tgr; R 4 = DNal(2), Dh Arg(Et) 2 Dh Arg(Bu), Dh Arg(CH 2 CF 3) 2 R 5 = Arg, L-Arg(Et) 2 L-hArg(Bu), L- hArg(CH 2 CF 3) 2 R 6 GlyNH 2 DAla NH 2

Oppfinnelsen vedrører fastfasesyntese av en hormonanalog som frigjør luteiniserende hormon (LH-frigjørende hormon) ved bruk av minimal beskyttelsesmetoden. LH-frigjørende hormonanaloger (heretter referert til som LH-RH) er nona- eller dekapeptider som er strukturelt relatert til LH-RH og viser biologisk aktivitet som ligner på LH-RH. Analogene er gjenstand for omfattende klinisk forskning på grunn av deres demonstrerte evne til å lindre symptomer på endometriose, prostatakreft, tidlig pubertet og andre hormonmedierte sykdommer. Til tross for at visse LH-RH-analoger for tiden er egnet for terapeutisk bruk, er syntesen deres en kompleks prosess, og derfor øker den kostbare metoden for deres fremstilling kostnadene for analogene som er så nødvendige for behandling. LH-RH-analoger er tradisjonelt beskrevet som enten agonister eller antagonister, avhengig av deres virkemåte. LH-RH-analogene ifølge oppfinnelsen er nona- og dekapeptider og inkluderer både agonister og antagonister. Eksempler på LH-RH-agonister som er nyttige i foreliggende oppfinnelse inkluderer nafarelin, leuprorelin, buserelin, goserelin, hysterelin, triptorelin og deslorelin, som skiller seg fra naturlig forekommende LH-RH ved å erstatte glycinresten i posisjon 6 med en D-aminosyre. Syntetiske agonister deler et naturlig forekommende hormon med et histidin i posisjon 2, et serin i posisjon 4 og et tyrosin i posisjon 5, som alle har reaktive sidekjeder som kan bli syntetisk vanskelig. LH-RH-antagonister skiller seg fra naturlig forekommende LH-RH, vanligvis ved delesjon eller substitusjon av histidinresten i posisjon 2. Fra et syntetisk perspektiv reduserer delesjon av histidin sannsynligheten for uønskede bivirkninger, men tilstedeværelsen av serin og tyrosin fortsatt krever spesielle tiltak for å eliminere forekomsten av sidekjedereaksjoner. LH-RH-analoger kan syntetiseres ved forskjellige metoder, slik som de beskrevet av J.M. Stewart og J.D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis, Ui. H. Freeman Co. San Francisco, 1969; J. Meinenhofer, Hormonal Proteins and Peptides, bind 2, s. 46, Academic Press (New York), 1973; og E. Schroeder og K. Luebke, Peptides, Volume l", Academic Press (New York), 1965. Metodene kan bredt karakteriseres som enten løsningsfase- eller fastfaseteknikker. Begge metodene involverer sekvensiell tilsetning av aminosyrer til den voksende peptidkjeden. Typisk er enten amino- eller karboksylgruppen til den første aminosyren beskyttet av en passende beskyttelsesgruppe. Den beskyttede aminosyren kan deretter enten festes til en inert fast bærer eller brukes i løsning ved å tilsette den neste beskyttede aminosyren i rekkefølge under betingelser som er egnet for amidbindingsdannelse. Beskyttelsesgruppen spaltes deretter fra denne nylig tilførte aminosyreresten, hvoretter neste aminosyre tilsettes, og så videre. Når alle de nødvendige aminosyrene er festet i riktig sekvens, fjernes eventuelle gjenværende beskyttende grupper og eventuell fast bærer for å produsere det endelige polypeptidet. Ved en enkel modifikasjon av denne generelle teknikken er det mulig å tilsette mer enn én aminosyre om gangen til en voksende kjede, for eksempel ved å koble et beskyttet tripeptid til et beskyttet dipeptid for å produsere et pentapeptid. De strengere betingelsene for fastfasesyntese krever vanligvis at eventuelle reaktive sidekjeder på aminosyrene beskyttes under amidbindingsdannelse. Sidekjedebeskyttende grupper fjernes vanligvis i et separat trinn etter spaltning av det resulterende polypeptidet fra den inerte bæreren, eller i forbindelse med denne spaltningen. En spesielt nyttig fastfase-syntesemetode for fremstilling av LH-RG-analoger er beskrevet i US-patent nr. 4.234.571 (Nestor et al.), hvis beskrivelse er inkorporert heri som referanse. I denne generelle tilnærmingen er -amino(N)-funksjonen til hver aminosyre beskyttet av en syre- eller basesensitiv gruppe slik som tert-butyloksykarbonyl (Boc); Eventuelle reaktive sidekjeder, slik som de som er tilstede på serin, histidin og tyrosin, er også beskyttet av sterkt bundne grupper som krever behandling med hydrogenfluorid (HF) eller lignende radikale teknikker for å fjerne dem. I tillegg utføres fjerningen av a-aminobeskyttende grupper og sidekjedebeskyttende grupper vanligvis i et separat trinn. Denne tilnærmingen er tilstrekkelig for å skaffe forskningsmengder av peptider, men for storskala produksjon av peptider er disse metodene utilstrekkelige. Aminosyrer med fullt beskyttede sidekjeder er dyre, og slike kostnader kan være en vesentlig faktor i kommersiell produksjon av peptider. I tillegg fører bruken av hydrogenfluorid, for ikke å snakke om miljøforurensningen, til kommersielt uakseptable tap i produktutbytte. Enda viktigere, på grunn av bruken av et separat produksjonstrinn for å fjerne sidekjedebeskyttende grupper, krever syntetisk prosess ekstra tid og kostnader. Alternativene er ikke mer attraktive. Tien et al. Pept. Chem. 375-379, T. Shiba og S. Sakakibara (red.), Protein Research Organization, Osaka (1088), skisserte syntesen av LH-RH ved bruk av tosylbeskyttelse på histidin og benzylbeskyttelse på tyrosin og serin. Denne tilnærmingen, som eliminerer behovet for å bruke hydrogenfluorid, krever fortsatt et separat dehydrogeneringstrinn for å fjerne benzylbeskyttende grupper; i dette tilfellet oppstår en viss reduksjon av tryptofan. Coy D.H. et al. Int. I. Peptide Protein Res. 14, 339-343 (1979), rapporterer syntesen av LH-RH-antagonister, (D-Phe2, D-Trp3, D-Jhe 6) LH-RH, ved bruk av en rekke sidekjedebeskyttelsesmetoder, som alle innebære fritak for HF fra beskyttelse; resulterer i benzylsidekjedebeskyttelse for kun serin, tosylsidekjedebeskyttelse for kun arginin, sidekjedebeskyttelse for serin og arginin, og sidekjedebeskyttelse for serin, arginin og tyrosin (med 2-brombenzyloksykarbonyl). Saltbeskyttelse av arginin (som Arg HCl) brukes også i "bare serin"-syntesen. Hydrogenfluorid brukes til å spalte det rå peptidet fra dets støtte og også for å spalte sidekjedebeskyttende grupper. Først når peptidet er "helt" ubeskyttet (og kun saltbeskyttelse i forhold til arginin) er det kun patentoppfinnerne som kan unngå fluorbehandling. Alle beskyttede synteser fører til dårlige resultater sammenlignet med ubeskyttede sidekjedesynteser. Coy et al. rapporterer videre syntesen av LH-RH-agonisten: etylamid (D-Leu 6 , des Gly-NH 2 10)-LH-RH, ved bruk av sidekjedebeskyttelse med dinitrofenyl kun i forhold til histidin, saltbeskyttelse av arginin, men uten HF-behandling. Sidekjedens dinitrofenylbeskyttende gruppe fjernes under spaltning av peptidet fra dets bærer ved å bruke en løsning av etylamin i dimetylformamid. Utbyttet fra syntesen med kun histidinbeskyttelse er kun 34 % sammenlignet med utbyttet fra syntesen med full beskyttelse og HF-behandling. Det er ingen sammenligning med ubeskyttet syntese. Tidligere teknikk antyder at blant ulike minimale beskyttelsesstrategier, kan beskyttelse av histidin alene resultere i økt utbytte sammenlignet med full beskyttelsessyntese for noen LH-RH-antagonister, men ingen sikker fordel kan utledes fra vurdering av disse sidekjedebeskyttelsestilnærmingene. LH-RH-agonister. I mellomtiden, ettersom en ideell tilnærming for å eliminere HF-avbeskyttelsestrinnet kan utføres i forhold til ubeskyttet syntese, fører mangelen på beskyttelse for histidin til overdreven racemisering. I samsvar med læren til Coy et al., har imidlertid søkeren oppdaget at bruken av kun histidinbeskyttelse også resulterer i høye nivåer av bis-serin-urenhet på grunn av acylering av serinresten. For å oppnå minimalt beskyttet syntese av LH-RH-analoger uten et avbeskyttelsestrinn, kreves det en betydelig forbedring i forhold til kjent teknikk som også kan gi beskyttelse for de gruppene som, når de ikke er beskyttet, har en skadelig effekt på renhet og gir peptid. Formålet med oppfinnelsen er å lage en fremgangsmåte for syntese av LH-RH-analoger, hvor sidekjedene til bare et minimum antall aminosyrerester er beskyttet. Et annet formål med oppfinnelsen er å tilveiebringe en fremgangsmåte for syntetisering av LH-RH-analoger som eliminerer behovet for HF-avbeskyttelse så vel som behovet for toksisk HF-reagens, og reduserer den giftige avfallsstrømmen som ofte finnes i konvensjonelle prosesser. Disse aspektene ved oppfinnelsen tilveiebringer de ytterligere fordelene ved å redusere kostnadene ved fremstilling av lH-RH-forbindelser, så vel som å eliminere det ekstra trinnet med sidekjedeavbeskyttelse. Formålene med oppfinnelsen oppnås med hensyn til LH-RH-analoger ved bruk av en midlertidig minimal beskyttelsesmetode hvor bare hydroksylsidekjeden til aminosyreresten er beskyttet av en gruppe som spaltes umiddelbart etter at serinen binder seg til peptidkjeden. En sidekjedebeskyttende gruppe er en gruppe som er labil under de samme betingelser som er egnet for fjerning av a-aminobeskyttende grupper. For de LH-RH-analogene som inneholder en histidinrest, kan imidazol-sidekjeden også beskyttes med en gruppe labil under koblingssyklusen, fortrinnsvis labil for avblokkeringsmidlet -aminogruppen, men den kan eventuelt beskyttes med en aminosyl eller ammonolyse spaltbar gruppe. Midlertidig serinsidekjedebeskyttelse og histidinsidekjedebeskyttelse, når tilgjengelig, minimerer dannelsen av urenheter og maksimerer produktutbyttet uten behov for et HF-avbeskyttelsestrinn. Den midlertidige minimumsbeskyttelsesmetoden ifølge oppfinnelsen er egnet for fastfasesyntese av ethvert serinholdig polypeptid som har noen få til mange rester, uavhengig av resten av sekvensen. LH-RH-analoger så vel som andre nona- og dekapeptider er foretrukne syntetiske mål. Selv om oppfinnelsen er blitt beskrevet i form av sekvensiell addisjon av individuelle aminosyrer, vil en fagmann på området forstå at metoden er like egnet for syntese der blokker av mindre polypeptider kobles for å danne større polypeptider, for eksempel ved å tilsette en tetrapeptid til et pentapeptid, forutsatt at sidekjeden av serinrester er midlertidig beskyttet under serinbindingssyklusen. Forbigående beskyttelse betyr at serinsidekjeden er beskyttet i en relativt kort periode av syntetisk syklus. Sidekjedebeskyttelsesgruppen og -amino- og karboksylbeskyttelsesgruppen spaltes av samtidig etter at serinkobling har funnet sted. Typisk er det avgjørende kriteriet for å velge en serinsidekjedebeskyttende gruppe at gruppen er stabil overfor bindingsbetingelser, men labil overfor avbeskyttelsesbetingelser fra a-aminogruppen. I en utførelsesform av den foreliggende oppfinnelse ved bruk av a-aminobeskyttelse, er serinsidekjeden fortrinnsvis beskyttet med en gruppe valgt fra t-butyl, t-butyldimetylsilyl, trimetylsilyl, trityl, pivalyl og tetrahydropyran-2-yl. For de LH-RH-analogene som har histidinrester, er det generelt ønskelig å beskytte imidazolsidekjeden. Denne beskyttelsen kan også være av den forbigående varianten, det vil si labil under bindingssyklusen, eller kan forbli på plass til peptidet er spaltet fra dets bærer. Fortrinnsvis brukes aminolyse eller ammonolyse for å spalte polymeren fra dens bærer og samtidig spalte histidinbeskyttende gruppen. I en annen utførelsesform av oppfinnelsen er blokkeringsmidlet valgt fra løsninger av hydrogenklorid i C3-C6-alkoholer og diklormetan. Fortrinnsvis er forholdet mellom alkohol og diklormetan fra 0,1 til 10,0 (volum) og syrekonsentrasjonen er fra 2 til 9 N. Mest foretrukket er alkoholen isopropanol. Forkortelser og definisjoner For formålet med oppfinnelsen refererer uttrykket "LH-RH" til hormonet frigjort av luteiniserende hormon, og "LH-RH-analoger" betyr LH-RH selv, så vel som andre polypeptider som er strukturelt relatert til eller avledet fra LH-RH, og som viser biologisk aktivitet som ligner på LH-RH. Forkortelser for ulike tradisjonelle aminosyrer er anbefalt av Commission on Biochemical Nomenclature fra International Union of Pure and Applied Chemistry i International Union of Biochemistry (IUPAC-IBC), Biochemistry, 11, 1726 (1972). Alle peptidsekvenser nevnt her er skrevet i henhold til den vanlige konvensjonen, med den N-terminale aminosyren til venstre og den C-terminale aminosyren til høyre. Forkortelser her representerer L-aminosyrer, unntatt den akirale aminosyren glycin, og med det andre unntaket av enhver ikke-naturlig aminosyre som er akiral, eller aminosyrer betegnet D- eller D, L-. Et står for etyl. Bu betyr butyl og iPr betyr isopropyl. Andre forkortelser som er nyttige for å beskrive oppfinnelsen inkluderer substitusjon av aminosyrer i det naturlige LH-RH-peptidet med følgende aminosyrerester: Aminosyre Forkortelsesrest 3-(2-naftyl)alanyl Nal (2) 3-(p-fluorfenyl)alanyl p-F-Phe 3-(p-klorfenyl)alanyl p-Cl-Phe 3-(3-pyridyl)alanyl Pal (3) NG ,N G" -bis(etyl) homo-arginyl hArg (Et) 2 N G ,N G" - bis(2,2,2-trifluoretyl)homoarginyl hArg (CH 2 CF 3) 2 N G -butyl-homoarginyl hArg (Bu) N E -Isopropyl-lysyl Lys (iPr) (benzyl)histidyl His (Bzl) Begrepet "farmasøytisk akseptabelt salter" refererer til salter som beholder den ønskede biologiske aktiviteten til den relaterte forbindelsen uten toksikologiske bivirkninger. Eksempler på slike salter er syreaddisjonssalter dannet med uorganiske syrer, for eksempel saltsyre, hydrobromsyre, svovelsyre, fosforsyre, salpetersyre og så videre; og salter dannet av organiske syrer, slik som for eksempel eddiksyre, oksalsyre, vinsyre, ravsyre, maleinsyre, fumarsyre, glukonsyre, sitronsyre, eplesyre, askorbinsyre, alginsyre, polyglutaminsyre, naftalensulfonsyre syre, naftalendisulfonsyre, polygalakturonsyre og så videre. Forkortelsen "N-Ac" refererer spesifikt til en N-acetylbeskyttende gruppe, det vil si en acetylgruppe festet til den terminale aminosyreresten på aminnitrogenet, i henhold til generelt akseptert nomenklatur. Foretrukne utførelsesformer I en utførelsesform tilveiebringer oppfinnelsen en forbedret minimumsbeskyttelsesmetode for fastfasesyntese av en forbindelse som har aminosyresekvensen med formelen: R1-R2-R3-Ser-Tyr-R4-Leu-R 5-Rro-R6 (1) hvor R1 er valgt fra (pyro)Glu og N-Ac-D-Nal (2); R 2 er valgt fra His. D-p-Cl-Phe og D-p-F-Phe; R3 er valgt fra Trp. D-Trp. R4 er valgt fra D-Nal-(2), D-hArg (Et)2. D-hArg (Bu), D-hArg (CH 2 CF 3) 2. R5 er valgt fra Arg, L-hArg(Et)2, D-hArg (Bu), D-hArg-(CH2CF3)2. R6 er valgt fra Cly-NH2, D-Ala-NH2, hvori aminosyrene er forsynt med N-beskyttelse, karakterisert ved at (a) midlertidig beskyttelse av serinsidekjeden i posisjon 4 utføres, passende, ved å bruke en gruppe som er labil for de midlene som er egnet for å spalte a-aminobeskyttende grupper uten å gjennomgå racemisering, sidereaksjoner eller spalting av det begynnende peptidet fra dets polymere bærer, og (b) beskytte histidinsidekjeden, hvis tilstede, med en gruppe labile for a-aminoavblokkeringsmidlet eller aminolyse, eller ammonolyse. I en annen utførelsesform tilveiebringer oppfinnelsen en midlertidig minimumsbeskyttelsesmetode for fastfasesyntese av en forbindelse med formel (l), hvor (a) a-aminogruppene til aminosyrer i polypeptidet er beskyttet, (b) serinsiden kjeden er beskyttet med en gruppe som er labil for de midlene som er egnet for spaltning med en -aminobeskyttende gruppe, (c) beskytte histidinsidekjeden, hvis tilstede, med en gruppe som er labil for de viktigste frigjøringsmidlene eller en gruppe som kan spaltes ved aminolyse eller ammonolyse, (d) koble den C-terminale aminosyren til en inert fast bærer, (e) koble sekvensielt, ved hjelp av et egnet koblingsmiddel, en eller flere utvalgte aminosyrer med hverandre i påfølgende sykluser, med utgangspunkt i C-terminus, (f) ved slutten av hver syklus fjernes beskyttelsesgruppene ved behandling med et deblokkerende middel, nevnte avblokkeringsmiddel er valgt fra midler som er i stand til å spalte både a-aminobeskyttelsesgruppen og sidekjedebeskyttelsesgruppen uten racemisering, sidereaksjoner eller spaltning av det voksende peptidet fra polymeren, (g) gjenta bindings- og spaltningstrinnene for å danne et ikke- og dekapeptid, (h) spalte polypeptidet fra underlaget ved aminolyse, eller ammonolyse og (i) ) isolering og rensing av det resulterende polypeptidet. I en annen utførelsesform tilveiebringer oppfinnelsen en fremgangsmåte for fastfase-syntese av en forbindelse med formel I, hvor (a) det tilsvarende Boc-beskyttede og tert-butyl-beskyttede serin er bundet ved fastfase-syntese i påfølgende sykluser og i rekkefølge fra høyre til venstre i forhold til aminosyresekvensen til forbindelsen med formel I, startende med Boc -R6-O-, kovalent bundet til en inert fast bærer, (b) fjern, i begynnelsen av hver syklus, Boc -beskyttende gruppe og samtidig tert-butylgruppen fra serin eller D-serin ved behandling med et avblokkeringsmiddel valgt fra HCl/CH 2 Cl 2 HCl (lavere alkanoyl) CH 2 Cl 2, for å danne en polypeptidbinding med den faste bæreren, (c) polypeptidet spaltes fra bæreren ved ammonolyse og (d) det resulterende polypeptidet isoleres. I en foretrukket utførelsesform tilveiebringer oppfinnelsen fremgangsmåten beskrevet ovenfor for å produsere et polypeptid med formelen ovenfor, hvor R1 representerer (pyro)Glu eller N-Ac-D-Nal (2); R2 er His eller D-p-Cl-Phe; R3 er Trp; R4 er D-Nal (2), D-hArg (Et)2; R5 er Arg eller L-hArg (Et)2 og R6 er Gly-NH2 eller D-Ala-NH2. I en foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen er -amino(N)-aminosyrefunksjonen beskyttet av en syre- eller basesensitiv gruppe. Beskyttelsesgruppen er motstandsdyktig mot betingelsene for dannelse av peptidbindinger, selv om den lett spaltes uten ødeleggelse av den voksende peptidkjeden eller racemisering av noen av de kirale sentrene som finnes i den. Egnede beskyttelsesgrupper inkluderer tert-butoksykarbonyl (Boc), bifenylisopropyloksykarbonyl, tert-amyloksykarbonyl, isobornyloksykarbonyl, -dimetyl, 3,5-dimetoksybenzyloksykarbonyl, o-nitrofenylsulfenyl, 2-cyano-tert-butyloksykarbonyl, 9-fluorenylmetyl-oksykarbonyl, og 9-fluorenyl-onyloksy. . Fortrinnsvis er a-aminobeskyttelsesgruppen tert-butoksykarbonyl (Boc). Når det er ønskelig å produsere et peptid slik som buserelin eller goserelin hvor R4 i formel (1) ovenfor er D-Ser (tert-Bu), er Fmoc foretrukket for N-beskyttelse i koblingssykluser som involverer og følger tilsetning av D -Ser (tBu). Fmoc er også labil for basiske reagenser (pH 8,5), som piperidin, som ikke spalter tBu fra D-Ser (tBu). I de siste syklusene etter tilsetning av D-Ser (tBu) er det nødvendig å bruke en basesensitiv N-beskyttelse. Serinsidekjeden i posisjon 4 er beskyttet av en gruppe som kan spaltes, for eksempel ved mild fluorbehandling. Den foretrukne serinsidekjedebeskyttende gruppe er tert-butyldimetylsilyl. Hydroksylsidekjeden til serinresten er beskyttet under bindingen av serinet til det voksende peptidet, som beskrevet for den generelle utførelsesformen av foreliggende oppfinnelse. Sidekjedebeskyttelsesgruppen fjernes etter kobling og før tilsetning av neste aminosyre. Sfjernes med det samme reagenset som brukes til å fjerne den N-beskyttende gruppen. Foretrukne serinsidekjedebeskyttende grupper er t-butyl, t-butyldimetylsilyl, trimetylsilyl, trityl, pivalyl og tetrahydropyran-2-yl. I tillegg er imidazolsidekjeden til histidin, vanligvis tilstede i LH-RH-agonister, også beskyttet. Den histidinsidekjedebeskyttende gruppen kan også være labil under bindingssyklusen, for eksempel labil for et N-gruppeavblokkerende middel, men eventuelt kan spaltningen utføres når peptidet spaltes fra dets bærer. Foretrukne sidekjedebeskyttende grupper for histidin er p-toluensulfonyl og 2,4-dinitrofenyl. For å starte syntese kobles den første aminosyren, som typisk er den C-terminale aminosyren i sluttproduktet, til en passende fast bærer. Egnede faste bærere i syntesen ovenfor er de materialene som er inerte overfor reagensene og reaksjonsbetingelsene ved trinnvise kondensasjonsavblokkerende reaksjoner, og som også er uløselige i mediet som brukes. Eksempler på kommersielt akseptable polymerer er styren/divinylbenzen-polymerer modifisert med en reaktiv gruppe, slik som klormetylert styren-divinylbenzen-kopolymer, hydroksymetylert styren/divinylbenzen-kopolymer, og så videre. Den foretrukne polymeren er Merrifield (1 % tverrbundet klormetylert styren-divinylbenzen-kopolymer). Festing til en polymer, for eksempel en klormetylert styren-divinylbenzen-polymer, utføres ved omsetning av en N-beskyttet C-terminal aminosyre, spesielt N-Boc-aminosyren, i form av dens cesium, tetrametylammonium, trietylammonium , 1,5-diazabicyklo(5.4.0) undec-5-en eller lignende salt i etanol, acetonitril, N,N-dimetylformamid (DMF) og så videre, spesielt cesiumsalt i DMF, med klormetylert polymer ved forhøyet temperatur, for for eksempel ca. 40-60°C, fortrinnsvis ca. 50°C, i en periode på ca. 12-72 timer, fortrinnsvis ca. 48 timer. Kobling av påfølgende beskyttede aminosyrer oppnås ved velkjente metoder, typisk i en automatisert peptidsyntesemaskin. Hver beskyttet aminosyre introduseres med omtrent 1,5-2,5 ganger molart overskudd, og kobling utføres i et inert, ikke-vandig, polart løsningsmiddel slik som diklormetan, DMF eller blandinger derav, fortrinnsvis diklormetan, ved omtrentlig romtemperatur. Koblingsmidlet er valgt fra N,N"-dicykloheksylkarbodiimid (DCC), N,N"-di-isopropylkarbodiimid (DIC) eller annet karbodiimid, enten alene eller i nærvær av 1-hydroksybenzotriazol (HBt), O-acylurinstoffer , benzotriazol-yl-hydroksy-tris(pyrrolidinofosfonium)heksafluorfosfat (PyBop), N-hydroksysuksinimid, andre N-hydroksyimider eller oksimer. Alternativt kan aktive estere av beskyttede aminosyrer (f.eks. p-nitrofenyl, pentafluorfenyl og lignende) eller symmetriske anhydrider brukes. Peptidpolymeren testes for fullstendig binding ved bruk av Kaiser-testen (Anal. Biochem. 34, 595 (1970) bortsett fra at i tilfelle av binding til prolin, blir Chloranil Test (Anal. Biochem. 117, 145 (1981)) eller Isatin Test (Anal. Chim. 118, 149 (1980)) brukt. Hvis fullstendighetstesten(e) indikerer at reaksjonen ikke er fullført, gjentas koblingen ved å bruke en ekstra aminosyre, men unnlatelse av blokkeringen av den ekstra syren. Når den siste koblingen er fullført, vaskes polymeren med metanol eller metanol som inneholder diklormetan og tørkes ved en maksimal temperatur på 60 ° C. Ved slutten av hver syklus, det vil si etter hver tilsetning av den neste N-beskyttede aminosyren til den voksende polypeptidkjeden, spaltes beskyttelsesgruppen ved behandling med et middel som låser opp. Når serin tilsettes, fjerner blokkeringsmidlet både N-Boc-beskyttelsesgruppen og serinbeskyttende gruppen. Foretrukne blokkeringsmidler inkluderer hydrogenklorid i diklormetan (HCl/-CH2Cl2), trifluoreddiksyre i diklormetan (TFA/CH2Cl2) og hydrogenklorid oppløst i en C3-C6 alkohol, fortrinnsvis isopropanol, blandet med diklormetan. Som regel varierer konsentrasjonen av HCl fra 2 N. til kl 9 fortrinnsvis fra 4 n. opptil 5 n. Forholdet mellom CH2Cl2 og C3-C6 alkohol er 0,1-10 (volum); fortrinnsvis ca. 1:1. Et spesielt foretrukket slippmiddel er 4,5N. løsning av HCl i i-PrOH: CH 2 Cl 2 (1:1). Opplåsingstrinnet finner typisk sted ved temperaturer fra 0 til 45°C, fortrinnsvis ved omgivelsestemperaturer (fra 20 til 27°C). En fagmann på området vil forstå at valget av en bindings-/avblokkeringsprotokoll ved bruk av andre midler enn de som er beskrevet ovenfor er passende forutsatt at serinresten avbeskyttes av et middel som oppfyller formålene med oppfinnelsen. HCl/iPrOH/CH 2 Cl 2-teknikken kan brukes for hver avbeskyttelsessyklus. Alternativt er en blandet metode der TPA/CH 2 Cl 2 brukes for visse sykluser og HCl/iPrOH/CH 2 Cl 2 for andre også akseptabel. Andre sykluser vil bli klare for spesialisten. Ved slutten av fastfasesyntesen spaltes polypeptidet fra polymerbæreren. Spaltningen utføres ved ammonolyse med en mettet ammoniakkløsning i et egnet løsningsmiddel for peptider med C-terminalen av alanin eller glycin; for peptider som har en prolin C-terminus, utføres spaltning ved bruk av aminolyse med et alkylamin eller fluoralkylamino. Spaltningen utføres ved en temperatur på fra ca. 10 til 50°C, fortrinnsvis ca. 25°C, i en periode på ca. 12-24 timer, fortrinnsvis ca. 18 timer. Egnede løsningsmidler inkluderer metanol, etanol, isopropanol, dimetylformamid, tetrahydrofuran, N,N-dimetyletanolamin, heksaner og blandinger derav. Fortrinnsvis anvendes en mettet løsning av ammoniakk i metanol. Alternativt kan peptidet spaltes fra polymeren ved basetransesterifisering etterfulgt av aminolyse. Polypeptidet renses deretter ved bruk av en serie kromatografiske trinn ved bruk av en eller alle av følgende typer: lett basisk harpiksionebytterkromatografi i acetatform; hydrofob absorpsjonskromatografi eller underrivatisert polystyren-divinyl-benzen (f.eks. Amberlite XAD) kromatografi; absorpsjonskromatografi på silikagel; ionebytterkromatografi på karboksymetylcellulose; partisjonskromatografi (f.eks. Sephadex G-25) eller motstrømsfordeling; høyytelses væskekromatografi (HPLC), spesielt omvendt fase HPLC på en oktyl- eller oktadecylsilylsilikakolonne. Hvis en racemisk aminosyre brukes i en eller flere av de 1, 2, 3 eller 6 posisjonene og de individuelle isomere produktene er av interesse, utsettes de diastereomere nonapeptid- eller dekapeptidendeproduktene for oppløsning og det ønskede polypeptidet inneholder D-aminoen syre i den passende posisjonen isoleres og renses, fortrinnsvis, under implementeringen av den ovenfor beskrevne kromatografiske prosedyren. Det isolerte og rensede polypeptidet omdannes eventuelt til et farmasøytisk akseptabelt salt. De følgende eksemplene sammenligner den midlertidige beskyttelsesmetoden ifølge foreliggende oppfinnelse med en ubeskyttet metode for både en LH-CRH-agonist og en LH-RH-antagonist. Disse eksemplene er kun presentert for spesifisitetsformål og er ikke ment å begrense omfanget av oppfinnelsen. Begge produktene i eksemplene 1 og 3 ved bruk av minimumssikkerhetsmetoden ifølge oppfinnelsen inneholder betydelig færre urenheter sammenlignet med produktene oppnådd i eksemplene 2 og 4 ved bruk av ubeskyttet syntese. I tillegg til færre urenheter, har fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse de ytterligere fordelene med høyere produktutbytte og bruk av mindre farlige reagenser, i en kortere tidsperiode og med mindre energiforbruk ved isolering og rensing av LG-RG-analoger. En ekstra fordel er produksjon av mindre mengder av en betydelig mindre giftig avfallsstrøm. Fremstilling A. Fremstilling av Boc-Gly-O-Polymer. 4,9 g N-Boc-glycin oppløses i en blanding av 50 ml metanol og 50 ml destillert vann. pH i løsningen justeres til 7,5 med vandig cesiumbikarbonat. Løsningsmidlet fjernes deretter i vakuum. Etter 18 timers tørking under høyvakuum oppløses resten i 150 ml tørr DMF. Tilsett 25 g 1 % klormetylert polystyren/divinylbenzen (Merrifield) polymer (tilsvarende 25 mmol klorid). Blandingen ristes ved 50°C i 24 timer, filtreres og polymeren vaskes suksessivt med DMF, vann og etanol. Polymeren ble tørket under vakuum i 3 dager for å oppnå 28,34 g Boc-Gly-O-Polymer. Fremstilling B. Fremstilling av Boc-Ala-O-polymer. I henhold til Preparat A-prosedyren tilsettes N-Boc-D-alanin til 1 % Merrifield-polymer for å produsere N-Boc-D-Ala-O-polymer. Eksempel 1. Syntese av nafarelin ved bruk av minimal serinbeskyttelse. I dette eksemplet fremstilles nafarelin ved å bruke følgende sidekjedebeskyttelsesmetode: saltbeskyttelse på arginin (som klorid), tosylbeskyttelse på histidin og tert-butylbeskyttelse på serin. N-Boc-aminosyrer ble oppnådd fra Bachem (Thorance, CA) (Leu, Tyr, His (Tos), Arg, Trp og Gly). Star Biochemical (Torrance, CA) (Pro og Ser (tBu), Swinte Tech (Albany, OR), (D-Nal (2). 4,0-4,5 N løsninger av HCl i i-PrOH/CH 2 Cl 2 (1/ 1) fremstilles ved å boble HCl inn i kald i-PrOH. Når løsningen er mettet (bestemt ved titrering: ca. 9 N), lagres den ved romtemperatur i ikke mer enn 3 dager og fortynnes med et likt volum CH 2 Cl 2 før bruk 1,0 mmol N -Boc-Gly-O-polymeren fra preparat A plasseres i en 5,0 L Veka 296 automatisert fastfase peptidsynthesizer-reaktor utstyrt med hjelperør og -kolber for å tilsette reagenser og for å skape økt trykk, trykkavlastning og opprettholdelse av en inert atmosfære av nitrogen Følgende aminosyrer tilsettes til N-Boc-Gly-O-polymeren ved DIC- eller HBt-assistert DIC-kobling i 3 timer: N-Boc-Pro (2,0 ekv.), N-Boc- Arg.HCl (2,0 ekv.); N-Boc-Leu, H20 (2.0 ekv.); N-Boc-D-Nal (2) (1-5 ekv.)/HBt; N-Boc-Tyr ( 1,5 ekv.)/HBt, N-Boc-Ser (tBu) (2,0 ekv.)/HBt, N-Bic-Trp (1,75 ekv.)/-HBt; N-Boc-His (Tos) (1,75 ekv.)/HBt; (pyro)Glu (2,5 ekv.)/-HBt. Følgende prosedyrer brukes for å fjerne den N-beskyttende gruppen etter hver tilsetning. Program A: polymeren vaskes først med CH 2 Cl 2 1 x 1 min, TFA CH 2 Cl 2 (40/60) 1 x 1 min, TFA CH 2 Cl 2 (40/60) 1 x 30 min, CH 2 Cl 2 5 x 1 min, Et 3 N CH 2 Cl 2 (5/95) 3 x 1 min, CH 2 Cl 2 4 x 1 min. Program B: polymeren vaskes først med CH2Cl2 1 x 1 min, 4,0-4,5 N HCl i CH2CL2/i-PrOH (1/1) 1 x 1 min, 4,0-4,5 n. HCl i CH 2 Cl 2/i-PrOH (1/1) 1 x 30 min, CH 2 Cl 2 3 x 1 min, DMF 1 x 1 min, Et 3 N CH 2 Cl 2 (5/95) 3 x 1 min, DMF 1 x 1 min, CH 2 Cl 2 4 x 1 min. Program A brukes til å fjerne N-beskyttende grupper på Gly, Pro, Arg, Leu, D-Nal (2) og Tyr. Program B brukes til å spalte de N-beskyttende gruppene på Ser, Trp og His, samt for å spalte sidekjedebeskyttende gruppen til serin. Etter at hvert avbeskyttelses- og vasketrinn er utført i henhold til protokoll A eller B, tilsettes den neste aminosyren i rekkefølgen til polypeptidkjeden og polymeren vaskes med CH 2 Cl 2 3 x 1 min, MeOH 4 x 1 min. , DMF 2 x 1 min og CH2Cl2 4 x 1 min. Etter å ha konstruert sekvensen spaltes peptidet fra polymeren ved behandling med en mettet løsning av ammoniakk i metanol ved en temperatur på ca. 25 o C i 18 timer.. Råpeptidet løses opp i 2M eddiksyre og omdannes til acetatsaltet. passerer gjennom en kolonne av AG3-X4A-harpiks (Bio-Rad), hvoretter acetatet oppløses i en minimal mengde metanol, og aceton tilsettes for å utfelle peptidet. Omvendt fase HPLC (Partisil ODS-3, 40 µm, acetonitril med 0,5 % eddiksyre) brukes til å fjerne polare og ikke-polare urenheter. Fraksjoner inneholdende minst 97% naferelinacetat ble kombinert og fortynnet med vann, deretter lastet på en omvendt fase HPLC-kolonne og vasket med 1% eddiksyre i vann. Resten utfelles, filtreres, vaskes og tørkes under vakuum. Aminosyreanalyse utføres på en Beckman 119CL aminosyreanalysator. Prøver for aminosyreanalyse blir hydrolysert med 4 N. løsning av CH3SO3H (0,2% -3-(2-aminometylindol)HCl) i 20 timer ved en temperatur på 110 oC. Analytisk HPLC utføres på en Spectra Physics 8800 kromatograf ved bruk av en ODS-11 kolonne fra Oltech , 5 μm , 4,6 x 250 mm, 10 μl injeksjon, strømningshastighet 1,5 ml/min, 27,5 % CH 3 CN, 72,5 % 0,16 M KR 2 PO 4, pH 5,1, temperatur 40 o C HPLC-analyse av et råpeptid hovedtopp ved 18 min for nafarelin og ingen urenheter ved 1 % ved 14 min. Eksempel 2. Syntese av nafarelin uten serinbeskyttelse. Prosedyren i eksempel 1 gjentas bortsett fra at N-Boc-Ser brukes i stedet for N-Boc-Ser (tBu). HPLC-analyse viser en hovedtopp med en retensjonstid på 18 minutter for nafarelin, samt 8,1 til 11,5 % urenhet ved en retensjonstid (RT) på 14 minutter. I tillegg er utbyttet fra denne "ubeskyttede" syntesen omtrent lik utbyttet fra en fullstendig beskyttet syntese ved bruk av hydrogenfluoridbehandling; i sistnevnte tilfelle er produktutbyttet betydelig lavere enn det oppnådd som et resultat av syntesen med midlertidig beskyttelse i eksempel 1. Eksempel 3. Syntese av LH-RH-antagonister ved bruk av midlertidig serinbeskyttelse. I dette eksemplet er LH-RH-antagonistene, N-Ac-D-Nal (2) D-pCl-Phe-Pal (3) Ser-Tyr-D-hArg (Et 2) Leu-hArg (Et 2) Prp- D-Ala NH 2 er fremstilt ved å bruke følgende sidekjedebeskyttelsesprotokoll: saltbeskyttelse mot L- og D-hArg (Et 2) (som klorid) og tert-butylbeskyttelse av serin. N-Boc-aminosyrer ble oppnådd fra Bachem (Torrance, California) D-Ala, Arg og Leu); Star Biochemicals (Torrance, CA), (Pro); Sinte Tech (Albany, Orgen) (D-Nal (2)), Incel (Milwaukee, WI) (D-Pal (3)), og UCB Bioproducts (Belgia) (p-Cl-Phe). Aminosyrer ble tilsatt til Na-Boc-D-Ala-polymeren fra fremstilling B i følgende sekvens: N-Boc-Pro (2,3 ekv.); Na-Boc-hAtg (Et)2. HCl (1 ekv.)/HBt; Na-Boc-Leu, H20 (2,3 ekv.); Na-Boc-D-hArg (Et)2. HCl (1,6 ekv.)/-HBt; Na-Boc-Tyr (2,1 ekv.)/HBt; Na-Boc-Ser (tBu) (2,0 ekv.); Na-Boc-D-Pal (3) (1,8 ekv.)/HBt; Na-Boc-D-p-Cl-Phe (2,0 ekv.); Na-Boc-D-Nal (2) (2,1 ekv.)/HBt; eddiksyreanhydrid. Acetylering utføres etter Ala, Pro og Leu. Overskudd av HBt (2 ekv.) brukes til å binde de basiske aminosyrene, hArg (Ey) 2 og Pal (3). Aminosyrene kobles ved DIC- eller HBt-mediert DIC-kobling i 3 timer og polymeren vaskes suksessivt med CH 2 Cl 2 3 x 1 min, MeOH 4 x 1 min, DMF 2 x 1 min og CH 2 Cl 2 4 x 1 min. Følgende protokoll brukes til å spalte den N-beskyttende gruppen etter hver tilsetning av aminosyrer. Program A: polymeren vaskes først med CH 2 Cl 2 1 x 1 min, TFA CH 2 Cl 2 (40/60) 1 x 1 min, TFA CH 2 Cl 2 (40/60) 1 x 30 min, CH 2 Cl 2 5 x 1 min, Et 3 N CH 2 Cl 2 (5/95) 3 x 1 min, CH 2 Cl 2 4 x 1 min. Program B: polymeren vaskes først med CH 2 Cl 2 1 x 1 min, 4,0-4,5 N. HCl i CH2Cl2/-iPrOH (1/1) 1 x 1 min, 4,0-4,5 N. HCl i CH 2 Cl 2/i-PrOH (1/1) 1 x 30 min, CH 2 Cl 2 3 x 1 min, DMF 1 x 1 min, Et 3 N CH 2 Cl 2 (5/95) 3 x 1 min, DMF 1 x 1 min, CH 2 Cl 2 4 x 1 min. Program A brukes til å fjerne beskyttelsesgruppene på Ala. Pro, D-hArg (Et) 2 , Leu og D-Nal (2), Program B brukes til å fjerne beskyttelsesgruppene på D-hArg (Et) 2, Tyr, Ser, D-Pal (3) og p- Cl-Ph. Etter hver avbeskyttelse og vask, i henhold til protokoll A eller B, tilsettes neste aminosyre i rekkefølge og polymeren vaskes med CH 2 Cl 2 3 x 1 min, MeOH 4 x 1 min, DMF 2 x 1 min, CH 2 Cl 2 4 x 1 min. Når sekvenseringen er fullført, spaltes peptidet fra polymerbæreren ved behandling med en mettet ammoniakkløsning i metanol i ca. 18 timer ved en temperatur på ca. 25°C. Det urene peptidet løses først i 2M eddiksyre og omdannes til acetatsaltet ved å passere gjennom en kolonne av AG3-X4A-harpiks (Bio-Rad). Acetatet underkastes silikagelkolonnekromatografi (CH2Cl2/i-PrOH/MeOH/H20/HOAc som løsningsmiddel); Acetatfraksjonene oppløses i vann og settes på en reversfasekolonne (Vydec c-18, 15-20 µm) og renses ved bruk av acetonitril/TEAP (pH 3,0). Fraksjoner med ønsket renhet kombineres og fortynnes med vann, deretter påføres en reversfase HPLC-kolonne, vaskes deretter med 1 % eddiksyre i vann. Peptidet desorberes med en blanding av MeOH/CH3CN/HOAc/H20 (44/50/1/5). Resten oppløses i metanol eller eddiksyre og utfelles i nærvær av eter, filtreres, vaskes med eter og tørkes i vakuum. Aminosyreanalyse utføres på en Beckman 119CL aminosyreanalysator. Prøver for aminosyreanalyse blir hydrolysert med 6 N. HCl-løsning ved en temperatur på 110 o C i 20 timer Analytisk HPLC utføres på en Spectra Physics 8800 kromatograf ved bruk av Spherisord C-8 (Oltech), 5 µm, 4,6 x 250 mm, 10 µl injeksjon, strømningshastighet 1,5 ml/ min, 30 % CP3CN. 70 % NH 4 H 2 PO 4 0,04 M, dimetyloktylamin 4,3 x 10-3, temperatur 40 o C. Syntese av antagonisten bekreftes ved tilstedeværelse av en hovedtopp ved en retensjonstid på 18 minutter; ingen andre topper ble påvist ved 1 % ved en retensjonstid på 16 min. Eksempel 4. Syntese av LH-RH-antagonist uten midlertidig serinbeskyttelse
Eksempel 3 gjentas ved bruk av N-Boc-Ser i stedet for N-Boc-Ser (tBu). HPLC-analyse viser tilstedeværelsen av en hovedtopp ved en retensjonstid på 18 minutter i forhold til antagonisten og tilstedeværelsen av en urenhet ved en konsentrasjon på 6,5 % i forhold til en retensjonstid på 16 minutter. De følgende kravene viser og gjør krav på gjenstanden for en teknisk løsning som søkeren anser for å være hans oppfinnelse. De følgende kravene er ment å dekke hele spekteret av ekvivalente løsninger anerkjent av fagfolk på området knyttet til fastfase-peptidsyntese.

Peptidbindingen har egenskapene til en delvis dobbeltbinding. Dette kommer til uttrykk i en reduksjon i lengden på denne bindingen (0,132 nm) sammenlignet med lengden på en enkel C N-binding (0,147 nm). Den delvis dobbeltkoblede naturen til peptidbindingen gjør det umulig for fri rotasjon av substituenter rundt den, derfor er peptidgruppen plan og har vanligvis en trans-konfigurasjon (formel I). Dermed er ryggraden i peptidkjeden en serie stive plan med et bevegelig ("hengsel") ledd på stedet der de asymmetriske C-atomene er lokalisert (i form I, indikert med en stjerne).

I peptidløsninger observeres preferansedannelsen av visse konformatorer. Når kjeden forlenges, får ordnede elementer i den sekundære strukturen mer uttalt stabilitet (ligner på proteiner). Dannelsen av en sekundær struktur er spesielt karakteristisk for vanlige peptider, spesielt polyaminosyrer.

Egenskaper

Oligopeptider ligner i egenskaper på aminosyrer, mens polypeptider ligner på proteiner. Oligopeptider er som regel krystallinske stoffer som spaltes ved oppvarming til 200-300 0 C. De er svært løselige i vann, fortynnede syrer og alkalier, og nesten uløselige i organiske løsemidler. Unntak er oligopeptider bygget fra hydrofobe aminosyrerester.

Oligopeptider har amfotere egenskaper og kan, avhengig av surheten til mediet, eksistere i form av kationer, anioner eller zwitterioner. Hovedabsorpsjonsbåndene i IR-spekteret for NH-gruppen er 3300 og 3080 cm -1, for C=O-gruppen 1660 cm -1. I UV-spekteret er absorpsjonsbåndet til peptidgruppen i området 180-230 nm. Det isoelektriske punktet (pI) til peptider varierer mye og avhenger av sammensetningen av aminosyrerester i molekylet. PK a-verdiene til peptidene er ca. 3, for -H 2 ca. 8.

De kjemiske egenskapene til oligopeptider bestemmes av de funksjonelle gruppene de inneholder, samt egenskapene til peptidbindingen. Deres kjemiske transformasjoner ligner stort sett de tilsvarende reaksjonene til aminosyrer. De gir en positiv biuretreaksjon og ninhydrinreaksjon. Dipeptider og deres derivater (spesielt estere) ringslutter lett til diketopiperaziner. Under påvirkning av 5,7 normal saltsyre hydrolyseres peptider til aminosyrer innen 24 timer ved 105 0 C.

Peptidsyntese

Peptidsyntese bruker reaksjoner kjent fra organisk kjemi for fremstilling av amider og spesialutviklede metoder for syntese av peptider. For å lykkes med å utføre disse syntesene, er det nødvendig å aktivere karboksylgruppen, dvs. øke elektrofilisiteten til karbonylkarbon. Dette oppnås ved kjemisk modifisering av karboksylgruppen til aminosyrer. Typen av slik modifikasjon bestemmer vanligvis navnet på peptidsyntesemetoden.

1. Syrekloridmetode.

Metoden er basert på reaksjonen for å produsere amider ved å reagere syreklorider med de tilsvarende aminene. Det var på denne måten de første peptidene ble oppnådd. For tiden brukes denne metoden ekstremt sjelden, siden den er ledsaget av dannelse av biprodukter og racemisering av peptider.

2. Azidmetoden

Utgangsmaterialet i denne metoden er oftest etylesteren av en N-beskyttet aminosyre, hvorfra hydrazidet er oppnådd, sistnevnte omdannes med natriumnitritt i nærvær av saltsyre til syreazidet. Reaksjonen bruker vanligvis hydrazin, hvor et av nitrogenene er blokkert av en beskyttende gruppe (Z-karbobenzoksy eller karboretbutyloksygruppe), som unngår dannelsen av sidedihydrazider. Azider danner peptider når de interagerer med C-beskyttede aminosyrer under milde forhold.

Racemisering i denne metoden er minimert, men bivirkninger kan oppstå, nemlig: azider kan omorganiseres til isocyanater, som igjen, når de reageres med alkoholen som brukes som løsningsmiddel, danner uretaner.

3. Blandede anhydrider

Blandede aminosyreanhydrider med karbonsyrederivater, oppnådd, for eksempel ved bruk av isobutylklorkarbonat, er mye brukt i peptidsyntese:

Reaksjonen i denne syntesen utføres ved lave temperaturer (-10..-20 C), ganske raskt, noe som betydelig reduserer muligheten for dannelse av biprodukter og racemisering. Den raske trinnvise syntesen av peptider ved bruk av blandede anhydrider kalles REMA-syntese. Dannelsesmetoder ved bruk av blandede anhydrider er mye brukt i fastfase peptidsyntese.

Utførelse av peptidsyntese krever derfor overveielse og streng overholdelse av visse faktorer. Derfor, for å redusere dannelsen av biprodukter og racemisering, anbefales følgende typiske forhold for å utføre reaksjonen av peptidbindingsdannelse:

1) prosessen må utføres ved lave temperaturer, reaksjonstiden må være minimal;

2) reaksjonsmassen bør ha en pH nær nøytral;

3) organiske baser som piperidin, morfolin, etc. brukes som syrebindende reagenser;

4) reaksjonen utføres fortrinnsvis i vannfrie medier.

Fastfasesyntese

Fastfasesyntese er en metodisk tilnærming til syntesen av oligomerer (polymerer) ved bruk av fast uløselig transportør, som er en organisk eller uorganisk polymer.

På begynnelsen av 1960-tallet ble det foreslått en ny tilnærming for å løse isolasjons- og renseproblemene som oppstår i peptidsyntese. Senere har forfatteren av oppdagelsen av denne tilnærmingen, R.B. Merrifield beskrev i sitt Nobelforelesning hvordan dette skjedde: «En dag hadde jeg en idé om hvordan målet om mer effektiv syntese av peptider kunne oppnås. Planen var å sette sammen peptidkjeden i etapper, med den ene enden av kjeden festet til en solid støtte under syntesen." Som et resultat var isolering og rensing av mellomprodukter og målpeptidderivater ganske enkelt et spørsmål om å filtrere og vaske den faste polymeren grundig for å fjerne alle overflødige reagenser og biprodukter som var igjen i løsningen. En slik mekanisk operasjon kan utføres kvantitativt, er lett standardisert og kan til og med automatiseres. La oss se på denne prosedyren mer detaljert.

Fastfasesyntese er basert på det faktum at det første leddet til den fremtidige oligomeren er kovalent festet til "anker"-gruppen til N., kjedeforlengelse utføres med standard beskyttede monomerer i henhold til de vanlige skjemaene som brukes for syntese i løsninger . La oss konkludere. syntesestadiet oligomeren spaltes fra N. og renses ved passende metoder. Fastfasesyntese brukes hovedsakelig. for produksjon av polypeptider, oligonukleotider og oligosakkarider.

Under syntesen av polypeptider som N. mest. mye brukt er en kopolymer av styren og 1-2% divinylbenzen, modifisert ved innføring av en dimetoksybenzylklorid-ankergruppe for å feste den første aminosyren (med en beskyttet gruppe NH 2) ved C-terminalen, for eksempel:

Etter fjerning av den N-beskyttende gruppen utføres forlengelsen av polypeptidkjeden ved bruk av standardmetoder for peptidsyntese i løsning (se Peptider). Som kondenseringsmidler mest Karbodiimider brukes ofte eller aminosyrer er forhåndskonvertert til activir. etere.

I syntesen av oligonukleotider brukes makroporøse glass eller silikagel som N. Ankergruppen er karboksylgruppen, separert fra overflaten til N. special. "ben", for eksempel:



B-purin eller pyrimidisk base

I det første trinnet blir nukleosidet festet til bæreren ved 3"-hydroksylgruppen til deoksyribose, hvor hydroksylgruppen i posisjon 5" er beskyttet av en dimetoksytritylgruppe (CH 3 OS 6 H 4) 2 (C 6 H 5) C (DMTr); mengden av sistnevnte etter spaltningen kan lett måles spektrofotometrisk, som tjener som en mengde. egenskaper ved bærerbelastning og gjør det mulig å evaluere utbytter ved etterfølgende stadier av oligonukleotidkjedeforlengelse. Etter fjerning av DMTr-gruppen, utføres kjedemontering ved bruk av fosfitamider (form I; M. Kapozers, 1980) eller fosfonater (hydrofosfonater) (II; R. Strömberg, 1986):


For å utføre fastfasesyntese kreves høye utbytter (i nivået 96-99%) i hvert trinn av løsningen, samt effektive metoder for rensing og isolering av syntetiserte materialer. forbindelser.

Bruken av en fast fase gjør det mulig å betydelig forenkle og fremskynde hvert trinn i oligomerkjedeforlengelsen, siden separasjonen av overskytende komponenter, kondenseringsmidler og biprodukter tilstede i løsningen oppnås ved å filtrere reaksjonen. blanding og vasking av N. med et passende sett med løsninger. Dermed brytes prosessen med å sette sammen oligomerkjeden ned i en rekke standardoperasjoner: frigjøring av den voksende enden av kjeden, dosering av neste beskyttede monomer og kondenseringsmiddel, mating av denne blandingen til en kolonne med N. i en beregnet tid, og vask av N. med en passende løsning. Vekstsyklusen til en monomerenhet kan være automatisert.

Basert på automatisk skoleball. synthesizere er det et generelt kretsskjema (se figur). En rekke synthesizer-modeller er forskjellige i utformingen av høyttalerne og deres antall, metoden for tilførsel av reagenser og løsninger, etc. Kontroll og programmering utføres ved hjelp av en innebygd eller ekstern datamaskin.



Skjematisk diagram av den automatiske enheten. skoleball. synthesizers (den elektriske kontrolllinjen er indikert med en stiplet linje): 1 - tilførselsledning for monomerer (M 1, M n) og kondenseringsmiddel (CA); 2-linje for tilførsel av reagenser (for eksempel oksidasjonsmidler, acyleringsmidler, etc.) og løsningsmidler (P 1, P n); 3 - bytteventiler; 4-søyle med holder, utstyrt med fordeler. ventil; 5-fotometrisk celle; 6-meter; 7-kontroll- og programmeringsenhet; 8-skjermer.

Potensialet til fastfasesyntese ble demonstrert ved syntesen av ribonuklease A (R. Merrifield, 1969) og humant veksthormon (D. Yamashiro, 1970) med en lengde på henholdsvis 124 og 183 aminosyrer. Men på grunn av den lille, men konstante racemiseringen som skjer under dannelsen av en peptidbinding, syntetisert. proteiner har lav biol. aktivitet, derfor automatisk. synthesizere brukes kap. arr. for produksjon av korte polypeptider (10-30 enheter), inkludert for preparative