Sammendrag om emnet:

Proteinstørrelseseparasjon ved bruk av DDC-Na

Elektroforese av proteiner i et enkelt system er nyttig for proteinseparasjon, men ikke karakterisering. Den elektroforetiske mobiliteten til hvert protein i et enkelt system avhenger samtidig av proteinets masse, dets totale elektriske ladning, konfigurasjonen og pakkingsstivheten til proteinkulen. Bidraget til hver av disse faktorene er ukjent og kan variere betydelig avhengig av elektroforeseforholdene. For å etablere en streng korrelasjon mellom en av de listede parameterne og den elektroforetiske mobiliteten til proteinet, er det nødvendig å utelukke påvirkningen fra alle andre.

PAGE-elektroforese ved bruk av DDC-Na tillater separasjon av proteiner som bare skiller seg fra hverandre i molekylvekt. For å gjøre dette behandles proteinblandingen i det originale preparatet med ikke mindre enn et tre ganger overskudd av DDC-Na (i vekt). På grunn av hydrofobe interaksjoner binder vaskemidlet likt til de aller fleste proteiner i et forhold på 1,4 mg DDC-Na per 1 mg protein.

Det enorme overskuddet av fullstendig dissosierte sulfonsyrerester introdusert av vaskemidlet gjør i de fleste tilfeller rollen til proteinets egen ladning uviktig. På grunn av den elektrostatiske frastøtingen av tett plasserte negativt ladede svovelsyrerester, retter proteinkjeden seg ut og tar form av en stiv stang med en diameter på -1,6 m og en lengde som kun avhenger av antall ledd i denne kjeden, og derfor på molekylvekten til proteinet.

Samtidig med behandlingen av DDC-Na er det nødvendig å sikre muligheten for fullstendig utfolding av proteinkjeden, og for dette formålet å bryte alle kovalente S-S-bindinger inne i proteinmolekylet. For dette formålet, før elektroforese, behandles proteinet også med høy konsentrasjon (1%) (3-merkaptoetanol ved forhøyet temperatur.

Den elektrofretiske mobiliteten, dvs. migrasjonshastigheten ved en feltstyrke på 1 V/cm, til det stive DDC-Na-proteinkomplekset viser seg å være relatert til molekylvekten til proteinet (M) med det enkle forholdet A-BIgM, hvor A og B er koeffisienter avhengig av porøsiteten til gelen, temperatur og andre eksperimentelle forhold. Det er mer praktisk å representere verdien "og" i relative enheter, som uttrykker forholdet mellom migrasjonsveiene til proteinet og "ledende fargestoff" - bromfenolblått. La oss betegne dette forholdet Rf. En slik erstatning vil bare påvirke verdien av koeffisientene A og B, som vi bare vet at de er i dataene er eksperimentelle betingelser de samme for alle proteiner. De endrede verdiene til koeffisientene vil også være konstante verdier i dette eksperimentet. Derfor, i stedet for for å bestemme dem, bruker de metoden for sammenligning med "markører" kjent av deres masse. Samtidig med elektroforese av blandingen av proteiner som studeres, et separat spor på samme plate, dvs. under identiske eksperimentelle forhold, en blanding av kjente markører separeres. Med deres hjelp er avhengigheten logM = f (Rf) konstruert punkt for punkt, som naturligvis viser seg å være rettlinjet. Basert på denne avhengigheten er det mulig grafisk, fra de målte verdiene til Rf , for å bestemme verdiene av log M, og derfor M for det studerte proteinet A. Selvfølgelig bør all forbehandling med vaskemiddel og P-merkaptoetanol utføres strengt tatt det samme for dette proteinet og alle markører.

Valget av buffer i denne varianten spiller ingen rolle, siden ladningen til proteinet bestemmes av dets kompleks med DDC-Na. Vanligvis brukes en nøytral buffer med tilsetning av 0,1 % DDC-Na for å opprettholde vaskemiddel-proteinkomplekset."

For proteiner med en molekylvekt på mindre enn 12 tusen dalton, blir bestemmelsen av M upålitelig. For forskjellige proteinmasseområder anbefales det å bruke PAGE med forskjellige porøsiteter, i henhold til følgende tabell:

Område M (tusenvis av dalton) % PAAG 12-43 15 16-68 10 36-94 7,5 57-212 5

Prosessen med elektroforese og proteinfarging etter fullføring utføres som vanlig, men det er å foretrekke å vaske DDC-Na fra proteinet før farging ved å bløtlegge gelen i 50 % TCA over natten.

DDC-Na i kompleks med protein hindrer til en viss grad farging (stor negativ ladning!).

Todimensjonal PAGE-elektroforese

Fullstendig separasjon av en kompleks blanding av proteiner kan ikke alltid oppnås i ett elektroforetisk eksperiment. Det er alltid en mulighet for at forskjellige proteiner i et gitt elektroforesesystem migrerer i samme sone, enten på grunn av nærhet til størrelsene deres, eller på grunn av sammenfallende elektroforetiske mobiliteter ved en valgt pH-verdi, eller, til slutt, som en resultat av en kombinasjon av disse parameterne som er ugunstige for separasjon. Derfor, i komplekse tilfeller av fraksjonering av en blanding av proteiner, er det fornuftig å bruke separasjon i den første retningen som den første for separasjon i den andre, vinkelrett på den første retningen under endrede elektroforeseforhold.

For å gjøre dette kuttes sporet til den første retningen (uten sedimentering og farging av proteiner i den) og plasseres på startsonen til platen i den andre retningen (uten lommer). Kontakt mellom to geler sikres ved å fylle kontaktstedet med en smeltet agaroseløsning i samme buffer. Elektroforese utføres naturligvis i en retning vinkelrett på stripen. Hvert inhomogent bånd i det kan gi flere flekker i den andre retningen hvis proteinene i det under nye forhold får forskjellige elektroforetiske mobiliteter. Som et resultat, etter avsetning og farging, vises et mønster av flekker fordelt over hele overflaten ("fingeravtrykk") på platen. Antall flekker av ulike proteiner som kan registreres på en plate kan nå flere hundre. I fig. 42 reproduserer mønsteret av fordelingen av flekker oppnådd ved todimensjonal elektroforese av proteiner fra den store underenheten til en av bakteriene (i arbeidet til Mets, Bogorad Anal. Biochem. 57 200, 1974).

Ekstraksjon av proteiner fra gel etter elektroforese

For analytiske identifikasjonsformål kan proteiner fra PAGE (uten utfelling eller farging) overføres til et nitrocellulosemembranfilter. Slike filtre har evnen til å absorbere grunnleggende proteiner. Overføringen utføres ved å vaske proteinbåndene ut av gelen med en bufferstrøm i en retning vinkelrett på overflaten av platen. Filteret påføres direkte på den våte gelen. Apparatet for å gi bufferstrøm fra gelen til filteret vil bli beskrevet nedenfor i forbindelse med DNA-elektroforese.

Som et resultat produserer filteret "replikaer" av proteiner separert i gelen. For å identifisere dem kan karakteristiske reaksjoner brukes, noen ganger enzymatiske eller immune (se nedenfor), samt hybridisering med radioaktivt fosfor-merket DNA eller RNA, dersom disse proteinene in vivo bundet til DNA eller ribosomale proteiner som binder til ribosom-RNA ble utsatt for atskillelse.

Det viktigste som, fra et elektroforesesynspunkt, skiller nukleinsyrer fra proteiner er den betydelige totale negative ladningen forårsaket av dissosiasjonen av tallrike fosforsyrerester i bindingene mellom nukleosidene. pH i miljøet har liten effekt på denne ladningen. Derfor kan elektroforese ikke utføres i en buffer, men i en hvilken som helst egnet ioneholdig løsning, for eksempel i en svak alkaliløsning. I alle tilfeller tilsettes EDTA til det flytende mediet til en konsentrasjon på 1-2 mM. Dette er nødvendig for å blokkere virkningen av nukleaser og forhindre utfelling (spesielt RNA) av toverdige metaller.

Separasjonen av DNA- og RNA-fragmenter ved elektroforese må derfor kun utføres etter størrelse. Imidlertid kan disse størrelsene variere over et veldig bredt område: fra titalls nukleotidenheter til mange hundre tusen, og hvis de uttrykkes i form av molekylvekter, så fra flere tusen til hundrevis av millioner dalton.

Naturligvis, for fraksjonering av relativt korte fragmenter, brukes PAGE-elektroforese, og for separering av høymolekylært DNA brukes en mer grovporet bærer - agarose. Vi blir kjent med henne litt senere. I mellomtiden, i forbindelse med de foregående avsnittene, er det på sin plass å komme med noen kommentarer om DNA-elektroforese i PAGE. Følgende tabell gir anbefalinger for valg av gelporøsitet avhengig av størrelsen på relativt korte DNA-fragmenter, preget av antall basepar (bp):

P.O. rekkevidde (tingene)

Det siste området i denne tabellen inneholder de maksimale DNA-størrelsene som er tilgjengelige for automatisk nukleotidsekvensering. Denne revolusjonerende metoden for DNA-analyse vil bli diskutert i neste kapittel.

Nå, før jeg går videre til agaroseelektroforese, vil jeg introdusere studenter og lesere for nye ideer for fraksjonering av store DNA-fragmenter i PAGE ved å bruke den opprinnelige bruken av elektriske spenningspulser påført gelen. Disse pulsene påføres vekselvis i to innbyrdes perpendikulære retninger. Tanken her er denne. Selv et veldig langt og fleksibelt DNA-molekyl kan presse seg gjennom de relativt små porene i gelen hvis det forlenges i bevegelsesretningen mot "hoved"-anoden, for eksempel plassert i bunnen av platen. Spenningen tilføres denne anoden ikke konstant, men i pulser. Den andre "hjelpe" anoden skaper en elektrisk feltstyrke vinkelrett på hovedretningen for DNA-bevegelse mot bunnen av platen. Spenningen leveres også til den med ganske kraftige, men kortere pulser enn til hovedanoden, alternerende med dem.

Hensikten med det "vinkelrette" elektriske feltet er å rotere de lange molekylene av stort DNA slik at de i øyeblikket den "langsgående" pulsen påføres er i en posisjon som er gunstig til å bevege seg langs platen ned mot hovedanoden. Jo lengre DNA-kjedene er, desto langsommere vil de endre orientering og derfor saktere vil de bevege seg i ønsket retning. Forfatterne av metoden hevder at de på denne måten klarte å skille DNA-fragmenter opp til fem millioner basepar.

Agarose geler

Agarose er en spesielt ren fraksjon av et naturlig, lineært polysakkarid, agar, isolert fra tang. Vi har allerede møttes.

Molekylvekten til enkelt agarosetråder ligger i området 10-100 tusen dalton. Agarose for elektroforese leveres som et lyofilisert (vakuumtørket) pulver. Gelering oppstår når selv en veldig fortynnet varm løsning av agarose i en buffer avkjøles. Ved en temperatur på 84-96°C (og for noen typer agarose allerede ved 70°) smelter polymertrådene og danner en homogen gjennomsiktig væske med det omgivende vandige miljøet. Den har en uttalt temperaturhysterese - den fryser ved en temperatur på ca. 40°C. Når den avkjøles til denne temperaturen, danner selv 0,4 % agaroseløsninger sterke geler. For lavtsmeltende agarosetyper reduseres størkningstemperaturen til 30°. Denne funksjonen til agarose letter alle manipulasjoner med sine løsninger uten frykt for herding. Dessuten avkjøles suspensjonen av agarose smeltet i et kokende bad i vann til 50-55° og bare ved denne temperaturen tilsettes bufferkonsentratet og alle andre tilsetningsstoffer, og helles deretter i en form for elektroforese. Dette er praktisk og er ikke forbundet med forekomsten av termiske deformasjoner.

Under avkjøling samles de tilfeldig orienterte trådene av størknet agarose, takket være flere hydrogenbindinger mellom trådene, til bunter. Disse trådene, som fritt krysser hverandre, skaper et veldig storporøst og samtidig stivt romlig nettverk i væsken som omgir dem.

Porestørrelsen til en agarosegel er naturlig relatert til konsentrasjonen av dens opprinnelige løsning. Noen anbefalinger for å velge denne konsentrasjonen kan gis, hentet fra erfaringen med nukleinsyreelektroforese:

For nukleinsyrer av virus og store plasmider 0,4-0,5%.

For DNA-restriktorer som inneholder 5-20 tusen basepar, 0,7-0,8%.

For kortere DNA og dobbelttrådet RNA reo-virus restriksjoner, 1,5 %.

For ribosomalt RNA - 1,75%.

For mRNA- og DNA-restriksjoner opp til 1000 bp. - 2 %

Det er veldig enkelt å forberede en agaroseelektroforeseplate. Glasset i ønsket størrelse er dekket på alle sider langs kanten med kontinuerlig teip slik at den øvre kanten stikker noen millimeter over overflaten av glasset. Sistnevnte er plassert på et strengt horisontalt bord. Det beregnede volumet av fortsatt flytende agaroseløsning helles direkte på glasset. Deretter installeres en kam som ligner på den som er plassert i PAGE-formen før polymeriseringen i den nær den ene kanten av glasset. Bare denne gangen er kammen nedsenket i agarose vinkelrett på glasset (tennene skal imidlertid ikke berøre glasset). Etter at agarosen stivner, fjernes kammen, og danner dermed "brønner" for preparatene. Elektroforese utføres i en horisontal posisjon (i spor), og påfører veker som kommer fra reservoarer med buffere. Driftsfeltstyrkeverdien er 2-5 V/cm.

DNA, spesielt dobbelttrådet, så vel som RNA, er godt farget med et gult fluorescerende fargestoff - etidiumbromid. Dette fargestoffet har en positiv ladning, som gjør at det kan samhandle med fosfatgruppene til nukleinsyrer. I tillegg er den i stand til å interkalere (bygge inn) mellom basene til dobbelttrådet DNA, noe som fører til en kraftig økning i fluorescensen når den belyses med ultrafiolett lys. Farging kan også gjøres etter elektroforese ved å bløtlegge gelen i 0,5-1 time i en vandig løsning av fargestoffet (1 μg/ml) eller injisere den direkte inn i gelen. I sistnevnte tilfelle kan bevegelsen av båndene i gelen overvåkes. I dette tilfellet er glassplaten opplyst med en UV-lampe nedenfra. Fargefølsomheten er høy. Bånd som inneholder 0,01 µgDNA kan observeres og fotograferes.

Ved slutten av elektroforese kan DNA fikseres i gelen ved utfelling fra løsning ved å bløtlegge gelen i 70 % etanol.

Pipetter

Selvfølgelig ligner ikke moderne mikropipetter i det hele tatt de som brukes i skolens kjemi-laboratorium. Dette er deres struktur. Det ganske klumpete plasthåndtaket (utvendig) på pipetten kan holdes komfortabelt med fire fingre, slik at tommelen er fri til å trykke på knappen som stikker ut fra den øvre enden av håndtaket. Nedenfra kommer en lang, lett konisk metallstang ut av den, på enden av hvilken en konisk hul spiss laget av spesialplast er tett festet.

Håndtaket inneholder en mekanisme, hvor hoveddelen består av en svært nøyaktig tilpasset tynn sylinder og et stempel, presset opp av en fjær. Ved å trykke på knappen flyttes stempelet ned. Ved å senke spissen ned i væsken og slippe den tidligere trykket på knappen, trekk et volum på 1, 2, 3 eller flere mikroliter inn i spissen - i samsvar med kalibreringen av pipetten. Ved å trykke på knappen en gang til blir væsken helt ut av spissen. Spissene leveres sterilisert og er til engangsbruk.

Det er pipetter med evnen til å forhåndsjustere væskevolumet, for eksempel fra 2 til 20 mikroliter. Justering utføres ved å vri på skruehodet, som setter lengden på stempelslaget. Det valgte volumet indikeres av en gradert trommel tilknyttet skruen.

Effekt av DNA-sekundærstruktur

I den elektroforetiske oppførselen til enkelttrådede (denaturert DNA, RNA) og dobbelttrådede nukleinsyremolekyler, bestemmes mye av størrelsen deres. Når det gjelder korte polynukleotidkjeder, har deres native dobbelttrådete molekyl en mer rigid struktur enn et enkelttrådet molekyl av samme størrelse. Den bøyer seg vanskeligere når den passerer gjennom gelens romlige nettverk. På grunn av dette vil relativt korte dobbelttrådete DNA-fragmenter ligge bak denaturert DNA av samme lengde under PAGE-elektroforese. Denne situasjonen vil oppstå selv for DNA fra bakteriofag FH-174 med en molekylvekt på 3,5 millioner dalton. Men for større molekyler kan situasjonen være omvendt. Den lange dobbelttrådete kjeden viser seg å være ganske fleksibel: den beveger seg gjennom porene i gelen som om den "vrir seg som en slange." I mellomtiden brettes en enkeltstrenget kjede av samme lengde til en løs "kaotisk ball" av en slik størrelse at bevegelsen i gelen er vanskeligere. Denaturert DNA i dette tilfellet henger etter det native DNA under elektroforese. Naturligvis avhenger reverseringsgrensen for den beskrevne effekten av størrelsen på gelporene.

Viralt og mitokondrielt dobbelttrådet DNA, så vel som bakterieplasmider, har strukturen til en lukket dobbelttrådet ring. Den opprinnelige tilstanden til en slik ring er "supervridd" (det tilsvarer et minimum av indre spenninger). Ringen som helhet er brettet til en "bunt", noe som øker kompaktheten (form I). Hvis et enkelt brudd i sukker-fosfatkjeden vises i minst en av de to snoede trådene i ringen, utfolder bunten seg, og under påvirkning av kreftene til elektrostatisk frastøtning av fosfatgruppene, retter ringen seg ut. Kompaktheten til molekylet avtar, dets ytre dimensjoner øker (form II). Når det gjelder et lineært dobbelttrådet DNA-molekyl (form III), avhengig av den gjennomsnittlige porestørrelsen til gelen, kan det migrere raskere eller langsommere enn en superkveilet ring med samme masse. For en storporøs gel kan kompaktheten til Form I være en avgjørende faktor; for mindre porer kommer den større fleksibiliteten til det lineære DNA-molekylet (form III) i forgrunnen.

Migrasjonshastigheten til lineære dobbelttrådete DNA-molekyler avtar med økende masse, men bare til en viss grense. Ved en molekylvekt større enn 5 millioner i en 1,6 % agarosegel og ved en molekylvekt større enn 12 millioner dalton i en 0,8 % agarose, migrerer molekylene med i det vesentlige samme hastighet, uavhengig av deres masse. I disse tilfellene spiller fleksibilitet en avgjørende rolle - evnen til svært lange molekyler, når de vris, passerer gjennom gelen like lett (eller like vanskelig) uansett lengde.

Ribosomalt RNA kan ha en sekundær struktur som er betydelig mer ugunstig for migrering i en gel enn DNA. Faktum er at i store RNA-molekyler er denne strukturen representert av mange "hårnåler" som stikker ut i alle retninger. Dette er steder for lokal sammenkobling til stive dobbelttrådete strukturer av individuelle, ofte langt fjernt fra hverandre i hovedsekvensen, komplementære RNA-regioner. Et slikt molekyl kan ikke lenger bevege seg gjennom porene i gelen. Når du setter sammen hovedsmørbrødet (gel, filter og filterpapirarkene som passer til dem), bør du sjekke at det ikke er noen luftbobler igjen mellom dem.

Overføring av DNA til et nitrocellulosefilter tar 2-3 timer. Det skal bemerkes at korte DNA-fragmenter holdes dårlig tilbake på et nitrocellulosefilter. Hvis dette er betydelig, er det bedre å bruke filtre laget av det såkalte "diazopapiret" eller "DBM-papiret". Whatman-selskapet produserer det under navnet "Whatman 540".

Litteratur

1 Kurashvili L.V. Forstyrrelser i lipidmetabolismen i spenningstilstander. II Zakharyinsky-lesninger. Sammendrag av rapporter. - 1995. -S.127.

2 Kurashvili L.V. Aktivitet av lipase og LCAT under langvarig dehydrering. I boken: Aktuelle problemstillinger innen diagnostikk, behandling og rehabilitering av pasienter. Sammendrag av rapporter. - Penza, 1995. -P.71-72.

3 Kurashvili L.V. Fosfolipidstatus ved nedsatt vann-elektrolyttmetabolisme. I boken: Aktuelle problemstillinger innen diagnostikk, behandling og rehabilitering av pasienter. Sammendrag av rapporter. - Penza, 1995.-P.69-70.

Dialyse er prosessen med å skille stoffer med høy molekylvekt og lav molekylvekt ved hjelp av semipermeable membraner. Proteinmolekyler, med stor molekylvekt, er ikke i stand til å trenge gjennom semipermeable partisjoner (kunstige og naturlige membraner). I dette tilfellet passerer partikler med lav molekylvekt (organiske og uorganiske) lett gjennom porene til semipermeable membraner.

Dialyse er mye brukt for å rense proteiner fra urenheter med lav molekylvekt (salt, sukker og andre), som lett passerer gjennom porene til semipermeable membraner. Enheten som dialyse utføres i kalles en dialysator. En cellofan- eller kollodiumpose plassert i et kar med vann representerer den enkleste dialysatoren (fig. 1). Proteinet som er plassert i posen forblir i den, og stoffer med lav molekylvekt diffunderer gjennom membranen og ut i vannet.

Albumin og globuliner kan separeres ved dialyse. Når salter går fra en proteinløsning til miljøet, vil globuliner utfelles, pga de er uløselige i et vandig miljø, og albuminer vil forbli i løsning. Den enkleste dialysatoren kan være en plastpose plassert i et glass vann. En saltvannsproteinløsning legges i en pose, mens molekyler av lavmolekylære stoffer (saltioner) diffunderer gjennom posens vegg, og store proteinmolekyler forblir inne i posen.

2 NН 4 + SO 4 2-

Figur 1 - Dialysatordiagram

Framgang. 10–15 ml av en eggehviteløsning som inneholder albuminer, globuliner og ammoniumsulfat legges i en plastpose og senkes i et glass destillert vann slik at væskenivået i posen stemmer med vannstanden. For å fremskynde dialyse er det nødvendig å skifte vannet i karet. Etter 1 time analyseres vannet fra glasset: en biuretreaksjon utføres i ett reagensrør og det sørges for at proteiner ikke passerer gjennom membranen; i et annet reagensrør utføres en reaksjon for SO 4 2- ionet ved å tilsette noen få dråper av en 10 % BaCI 2 løsning for å etablere saltets penetrering gjennom veggen til plastposen. Etter 2–3 timer dukker det opp et globulinbunnfall inne i posen, som filtreres. Proteiner fra albuminfraksjonen forblir i filtratet.

Globulin-naturen til proteinene i bunnfallet bevises ved å løse det opp i saltløsninger (10 % løsning av ammoniumklorid, natriumklorid osv.) Når løsningen fortynnes med vann, dannes det igjen et bunnfall.

Albuminnaturen til filtratproteinene bekreftes ved fortynning med vann med fravær av sediment eller fullstendig metning med ammoniumsulfat (bunnfall dannes).

Materialer og reagenser: en eggehviteløsning som inneholder albuminer, globuliner og ammoniumsulfat (se vedlegg B, avsnitt 5); 10 % bariumkloridløsning; 10 % natriumhydroksidløsning; 1% løsning av kobbersulfat; 10% ammoniumkloridløsning; ammoniumsulfat, finmalt.

Utstyr: vanlige reagensrør; cellofan eller kollosjonspose; beger eller kar for 1–2 ml; 10 ml målepipetter; pipetter.

Kontrollspørsmål

1. Prinsippet for dialyseprosessen.

2. Enheten til en enkel dialysator.

3. Til hvilke formål brukes dialyse?

4. Hvorfor kan globuliner (saltløselige proteiner) skilles fra globuliner (vannløselige proteiner) ved dialyse?

5. Hvordan bevise globulin- og albumin-naturen til proteiner når de separeres?

Analyse og isolering av peptider (proteiner)1.
Preparativ separasjon - separasjon av en eller flere
individuelle blandingskomponenter
2.
Analytisk separasjon – identifikasjon og kvantifisering
bestemmelse av komponenter i en blanding (inkludert kjemiske og
stereokjemisk renhet)
Analytisk separasjon kan gå foran forberedende
for å velge en separasjonsmetode og bestemme dens optimale
forhold.

Separasjonsmetoder

1. Omvendt fase høyytelses væskekromatografi
- brukes til separasjon av proteiner og peptider, den mest populære
HPLC-alternativ
2. Ionebytterkromatografi er en mye brukt i praksis
isolasjonsmetoder
3. Gelpermeasjonskromatografi (gelfiltrering) – separering i
basert på molekylvekt
4. Affinitetskromatografi - separasjon vha
biospesifikke ligander
5. Elektroforese - separasjon av proteiner og peptider basert på div
mobilitet i et elektrisk felt
6. Flerdimensjonal separasjon – 2D elektroforese og flerdimensjonal
kromatografi er den mest strenge analysemetoden

Hvordan skiller proteiner (peptider) seg fra hverandre?

Eiendom
Forskjeller
Separasjonsmetode
Aminosyre
sammensatt
Lade
molekyler
Hydrofobicitet
Ionebyttekromatografi
Kapillær elektroforese
Hydrofob kromatografi
Spesifikk
nettsteder
bindende
Tilhørighet for andre
molekyler
Affinitetskromatografi
Antall AKostater
Størrelse
Gel-penetrerende
kromatografi
Gelelektroforese

Skjematisk diagram av kolonnekromatografi

1.
2.
3.
4.
Balansering
Eksempel på søknad
og spyling
Eluering
Regenerering

Ionebyttekromatografi

Prinsippet er samspillet mellom protein (peptid) ladninger med
ladede grupper på overflaten av bæreren.
Transportør:
For små peptider utføres kromatografi på
polymerkationbyttere (sulfonert kopolymer
styren og divinylbenzen) eller anionbyttere (-N+R3)
Bærere brukes til å isolere store peptider (proteiner)
(cellulose, dekstran, agarose) i stand til å svelle i vandig
miljø, og gir dermed bedre forhold
permeabilitet av store molekyler sammenlignet med harpiks på
polystyren basert.

Ionebytterkromatografi på SM-cellulose

Hydrofob kromatografi

Prinsippet er samspillet mellom hydrofobe grupper av bæreren med
hydrofobe områder (AA) av et peptid (protein)
Bærer: silikagel med podede hydrofobe kjeder
(eller grupper)
-
Ideell for å separere blandinger av små peptider
(for eksempel etter enzymatisk fordøyelse)
Høy separasjonshastighet
Reproduserbarhet
Høy følsomhet (små mengder)

Affinitetskromatografi

Oppgaven er å isolere et protein (peptid) med lavt innhold i en blanding (celleekstrakt,
biologiske væsker)
Prinsipp – biospesifikk binding (affinitet) av ligand og protein
Bærer: inert porøst materiale (agarose, polyakrylamid, tverrbundet
dextran, glassperler), som den er kovalent festet til gjennom et avstandsstykke
ligand
Ligand (monospesifikk): hormoner (reseptorer), enzymhemmere eller
analoger av enzymsubstrater (enzymer), antistoffer (antigener), proteiner
(rekombinante proteiner), lektiner (glykoproteiner), fosforylkolin (reaktivt protein).

C-reaktiv proteinaffinitetskromatografi

Som svar på infeksjon eller vevsskade, skarpt
konsentrasjonen av noen proteiner øker
blodplasma, som har det generelle navnet "proteiner
akutt fase." Disse proteinene inkluderer også C-reaktivt protein (CRP).
protein). C-reaktivt protein vises i
serum like etter vevsskade og
utbruddet av betennelse.
Menneskelig CRP består av fem identiske,
ikke-kovalent koblede polypeptidkjeder,
danner en lukket pentamer. Viktig
egenskapen til CRP - evnen til å binde seg til
fosforylkolin.
fosforylkolin
O
O
O
H
P
O
O
N
Meg
Meg
Meg
O
NH2
N
O
H
P
O
O
N
Meg
Meg
Meg
Biospesifikk sorbent

Gelkromatografi (gelfiltrering)

Prinsipp – separasjon av proteiner etter molekylvekt
(peptider)
Bærer: hydrofile dekstraner med tverrgående
tverrbindinger (Sephadexes) og polyakrylamidgeler
(biogeler), som er forskjellige i granulatstørrelse og
hyppigheten av tverrbinding. Medievalg
bestemt av molekylmassen til det delte
peptider (proteiner)
Ulempe - det er umulig å dele molekyler med kjære
av massene!!!

Elektoroforese

Proteinelektroforese er en metode for å separere en blanding av proteiner i fraksjoner eller individer
proteiner.
Proteinelektroforese brukes både til analyse av komponentene i en proteinblanding og for
oppnå et homogent protein.
Problem: Elektroforetisk mobilitet avhenger av ladningen til proteinet og dets molekylære
masse (romlig konfigurasjon)
Det vanligste alternativet for elektroforetisk analyse av proteiner er
elektroforese av proteiner i polyakrylamidgel i nærvær av natriumdodecylsulfat (SDSPAGE, 1970 av U. K. Laemmli).
SDS
1. proteiner etter behandling med SDS er fullstendig
denaturert tilstand;
2. antall SDS-molekyler assosiert med polypeptidet,
proporsjonal med lengden, og derfor molekylær
vekt;
3. polypeptidets egen ladning er ubetydelig sammenlignet med
ansvar for sikkerhetsdatabladet knyttet til det.
4. Polypeptider har samme spesifikke ladning og
deles omvendt proporsjonalt med logaritmen til dem
molekylær vekt.
For å visualisere resultatene av elektroforese, brukes gelfarging oftest.
Coomassie blå eller sølvfarge

2-D elektroforese

Atskillelse
på kostnad
Atskillelse
til størrelse
(SDS-SIDE)
Todimensjonal elektroforese (2-DE 2-D elektroforese) brukes til å analysere proteinmolekyler.
Proteinblandingen separeres i to retninger i henhold til 2 forskjellige egenskaper. Til slike eiendommer
inkluderer – isoelektrisk punkt, proteinmasse i naturlig og denaturert
betingelse.
Todimensjonal elektroforese begynner med endimensjonal elektroforese, og deretter utsettes det separerte molekylet for
den andre divisjonen i retning 90 grader mot den første foresen.
Det er usannsynlig at 2 molekyler vil ha to identiske individuelle egenskaper,
derfor separeres proteiner mer effektivt ved 2-D elektroforese enn ved konvensjonell elektroforese
elektroforese.
Isoelektrisk punkt (IEP) er pH-verdien der et molekyl ikke er ladet (nøytralt).
1. Separasjon ved isoelektrisk punkt
Separasjonen av proteiner (peptider) ved IEP kalles isoelektrisk fokusering (IEF). Ekorn
fordelt gjennom gelen i den første retningen og "akkumuleres ved det isoelektriske punktet
(proteinladningsnøytral)
2. Separasjon etter masse
Standard SDS-elektroforese brukes i en retning vinkelrett på den første.

Kjemospesifikk kromatografi

S-S-
HS-
Oppgaven er selektiv isolasjon fra en blanding
peptider som inneholder visse
funksjonelle grupper (oftest SH)
Prinsippet er dannelsen av en kovalent binding mellom
peptid og bærer
S-S
Bærer: Sepharose, porøst glass, silika,
som inneholder en disulfidgruppe
S-S
S-S
S
S
-SH

Spørsmål 1. Proteinets biologiske rolleBog peptider. Enkle og komplekse proteiner. Primære, sekundære strukturer av proteinet, kjemiske bindinger som stabiliserer dem. Funksjoner av sammensetningen og strukturen til kuleformede og fibrillære proteiner (keratin, kollagen, elastin).

PROTEINER eller PROTEINER er høymolekylære nitrogenholdige organiske stoffer, lineære heteropolymerer, hvis strukturelle komponenter er aminosyrer forbundet med peptidbindinger. Et peptid kalles vanligvis en oligomer som består av ikke mer enn 50 aminosyrer.

Strukturdannende funksjoner. Strukturelle proteiner er ansvarlige for å opprettholde form og stabilitet av celler og vev(kollagen, histoner - organisering av DNA-folding i kromatin, transportfunksjoner (hemoglobin)

Beskyttende funksjoner. (immunoglobulin G, som danner et kompleks med membranglykolipider på erytrocytter).

Regulatoriske funksjoner: proteiner fungerer som signalstoffer (hormoner) og hormonelle reseptorer (somatotropin, insulin)

Enzymatisk (alkoholdehydrogenase, glutaminsyntetase)

Motoriske funksjoner. Samspillet mellom aktin og myosin er ansvarlig for muskelsammentrekning og andre former for biologisk motilitet

Reservefunksjoner. Planter inneholder reserveproteiner, som er verdifulle næringsstoffer. I dyrekropper muskelproteiner tjene som reservenæringsstoffer som mobiliseres når det er absolutt nødvendig.

Proteiner: enkle (bare fra a/k), komplekse (består av apoprotein - proteindelen, og protesedelen - metall, organiske molekyler med lav molekylvekt)

ROMLIG ORGANISERING AV ET PROTEINMOLEKYL

Hvert protein er basert på en polypeptidkjede. Det er ikke bare forlenget i rommet, men organisert i en tredimensjonal struktur. Derfor er det et konsept med 4 nivåer av romlig organisering av protein, nemlig primære, sekundære, tertiære og kvaternære strukturer av proteinmolekyler.

Den primære strukturen til et protein er en sekvens av aminosyrefragmenter som er fast (og gjennom hele perioden av proteinets eksistens) forbundet med peptidbindinger. Det er en halveringstid for proteinmolekyler - for de fleste proteiner, ca. 2 uker. Hvis minst en peptidbinding brytes, dannes et annet protein.

Sekundær struktur er den romlige organiseringen av kjernen av polypeptidkjeden. Det er 3 hovedtyper av sekundær struktur:

1) Alfaspiral - har visse egenskaper: bredde, avstand mellom to omdreininger av spiralen. Proteiner er preget av en høyrehendt helix. Det er 36 aminosyrerester per 10 omdreininger i denne helixen. For alle peptider arrangert i en slik helix er denne helixen helt den samme. Alfa-helixen er fiksert ved hjelp av hydrogenbindinger mellom NH-gruppene i en omdreining av helixen og C=O-gruppene i den tilstøtende svingen. Disse hydrogenbindingene er plassert parallelt med helix-aksen og gjentas mange ganger, og holder derfor fast på helixstrukturen. Dessuten holdes de i en litt spent tilstand (som en komprimert fjær).

Beta foldstruktur - eller foldet arkstruktur. Det er også fiksert av hydrogenbindinger mellom C=O og NH-grupper. Fikserer to deler av polypeptidkjeden. Disse kretsene kan være parallelle eller antiparallelle. Hvis slike bindinger dannes innenfor det samme peptidet, er de alltid antiparallelle, og hvis de er mellom forskjellige polypeptider, er de parallelle.

3) Uregelmessig struktur - en type sekundær struktur der arrangementet av forskjellige seksjoner av polypeptidkjeden i forhold til hverandre ikke er regelmessig (konstant), derfor kan uregelmessige strukturer ha forskjellige konformasjoner.

Klassifisering av proteiner etter molekylær form

2 grupper: kuleformet og fibrillær. Globulære proteiner inkluderer proteiner hvis forhold mellom langsgående og tverrgående sider ikke overstiger 1:10, og oftere er 1:3 eller 1:4, dvs. proteinmolekylet har form som en ellipse. De fleste individuelle menneskelige proteiner er klassifisert som kuleproteiner. De har en kompakt struktur og mange av dem, på grunn av fjerning av hydrofobe radikaler inne i molekylet, er svært løselige i vann

Fibrillære proteiner har en langstrakt struktur, der forholdet mellom lengde- og tverraksen er mer enn 1:10. Fibrillære proteiner inkluderer kollagener, elastin, keratin, som utfører en strukturell funksjon i menneskekroppen, samt myosin, som er involvert i muskelkontraksjon, og fibrin, et protein i blodkoagulasjonssystemet.

Struktur og funksjoner til kollagener

Kollagener er en familie av beslektede fibrillære proteiner som skilles ut av bindevevsceller. Kollagener er de vanligste proteinene ikke bare i den intercellulære matrisen, men også i kroppen som helhet; de utgjør omtrent 1/4 av alle proteiner i menneskekroppen. I den ekstracellulære matrisen danner kollagenmolekyler polymerer kalt kollagenfibriller. Kollagenfibriller har enorm styrke og er praktisk talt ikke strekkbare. Det er derfor et stort antall kollagenfibre, bestående av kollagenfibriller, er en del av huden, sener, brusk og bein.

De uvanlige mekaniske egenskapene til kollagener er assosiert med deres primære og romlige strukturer. Kollagenmolekyler er bygd opp av tre polypeptidkjeder kalt a-kjeder. Kollagen inneholder 1000 aminosyrerester. Den primære strukturen til kollagen a-kjeder er uvanlig, siden hver tredje aminosyre i polypeptidkjeden er representert av glycin, opptil 1/4 av aminosyrerestene er prolin eller 4-hydroksyprolin, og omtrent 11 % er alanin. Kollagen mangler aminosyrer som cystein og tryptofan, og inneholder kun svært små mengder histidin, metionin og tyrosin. Den primære strukturen til a-kjeden av kollagen inneholder også en uvanlig aminosyre - hydroksy-lysin. Polypeptidkjeden av kollagen kan representeres som en sekvens av Gly-X-Y-tripletter, hvor X og Y kan være hvilke som helst aminosyrer, men oftere er X-posisjonen prolin, og Y-posisjonen er hydroksyprolin eller hydroksylysin. Hver av disse aminosyrene er av stor betydning for dannelsen av kollagenfibriller.

På grunn av sin struktur forårsaker prolin bøyninger i polypeptidkjeden, og stabiliserer den venstrehendte spiralformingen. Helixen til kollagenpeptidkjeden stabiliseres ikke på grunn av hydrogenbindinger (siden prolin ikke danner dem), men av kreftene til sterisk frastøting av pyrrolidinringer i prolinrester. Som et resultat øker avstanden mellom aminosyrerester langs helixens akse, og den viser seg å være mer utfoldet sammenlignet med den tett snoede a-helixen av kuleproteiner.

Spiraliserte polypeptidkjeder, flettet sammen rundt hverandre, danner et tretrådet høyrehendt superhelisk molekyl, ofte kalt tropokollagen. Kjedene holdes tett inntil hverandre på grunn av hydrogenbindinger som oppstår mellom amino- og karboksylgruppene i peptidryggraden til forskjellige polypeptidkjeder som utgjør det trespiralformede molekylet. "Harde" aminosyrer - prolin og hydroksyprolin - begrenser rotasjonen av polypeptidstaven og øker dermed stabiliteten til trippelhelixen.

Glycin, som har et hydrogenatom i stedet for et radikal, er alltid plassert i skjæringspunktet mellom kjeder; fraværet av et radikal gjør at kjedene passer tett sammen.

Som et resultat av denne vridningen av peptidkjedene i polypeptidkjedene og tilstedeværelsen av en langstrakt struktur, ender to andre radikaler fra Gly-X-Y aminosyretriaden på den ytre overflaten av tropokollagenmolekylet. Noen komplementære seksjoner av tropokollagenmolekyler kan kombineres med hverandre, og danner kollagenfibriller, og disse seksjonene er plassert på en slik måte at den ene tråden av tropokollagen forskyves i forhold til den andre med ca. 1/4 (fig. 1-42). Ione-, hydrogen- og hydrofobe bindinger oppstår mellom aminosyreradikaler. Modifiserte aminosyrer spiller en viktig rolle i dannelsen av kollagenfibriller:

hydroksyprolin og hydroksylysin. Hydroksylgrupper av hydroksyprolin i nærliggende tropokollagenkjeder danner hydrogenbindinger som styrker strukturen til kollagenfibriller. Lysin- og hydroksylysinradikaler er nødvendige for dannelsen av sterke tverrbindinger mellom tropokollagenmolekyler, som ytterligere styrker strukturen til kollagenfibriller. I tillegg kan karbohydratrester (glykosylering av kollagen), hvis funksjon fortsatt er uklar, festes til hydroksylgruppen til hydroksylysin.

Dermed gjør aminosyresekvensen til kollagenpolypeptidkjeder det mulig å danne en struktur som er unik i sine mekaniske egenskaper og har enorm styrke. Endringer i den primære strukturen til kollagen kan føre til utvikling av arvelige sykdommer.

2. Struktur og funksjon av elastin

I motsetning til kollagen, som danner sterke fibriller som tåler store belastninger, har elastin (også et protein i den intercellulære matrisen) gummilignende egenskaper. Elastintråder som finnes i lungevev, i blodkarveggene og i elastiske leddbånd kan strekkes flere ganger sammenlignet med normal lengde, men etter at belastningen er fjernet, går de tilbake til en foldet konformasjon.

2. Struktur og funksjon av elastin

Elastin inneholder omtrent 800 aminosyrerester, blant disse dominerer aminosyrer med ikke-polare radikaler, som glycin, batting og alanin. Elastin inneholder ganske mye prolin og lysin, men bare litt hydroksyprolin; hydroksylysin er helt fraværende.

Tilstedeværelsen av et stort antall hydrofobe radikaler forhindrer dannelsen av en stabil kule; som et resultat danner elastinpolypeptidkjeder ikke vanlige sekundære og tertiære strukturer, men antar forskjellige konformasjoner i den intercellulære matrisen med omtrent lik fri energi (fig. 1-43). Dette er nettopp tilfellet med strukturen til den primære strukturen når fraværet av en stabil ordnet konformasjon fører til fremkomsten av egenskapene som er nødvendige for proteinet.

Egenskapene til strukturen og funksjonen til elastin er diskutert mer detaljert i avsnitt 15.

2. Tertiær og kvartær proteinstruktur, kjemiske bindinger som stabiliserer dem. Underenheter og domener. Kooperativ interaksjon av underenheter, betydning for funksjonen til proteiner.

TERTIÆR STRUKTUR

Dette er den tredimensjonale arkitekturen til en polypeptidkjede - et spesielt relativt arrangement i rommet av spiralformede, foldede og uregelmessige deler av polypeptidkjeden. Ulike proteiner har forskjellige tertiære strukturer. Disulfidbindinger og alle svake typer bindinger deltar i dannelsen av tertiærstrukturen.

Det er to generelle typer tertiær struktur:

1) B fibrillære proteiner (for eksempel kollagen, elastin) hvis molekyler har en langstrakt form og vanligvis danner fibrøse vevsstrukturer, er den tertiære strukturen representert av enten en trippel alfa-helix (for eksempel i kollagen) eller beta-plisserte strukturer.

2) B kuleformede proteiner, hvis molekyler har form som en ball eller en ellipse (latinsk navn: GLOBULA - ball), finnes en kombinasjon av alle tre typer strukturer: det er alltid uregelmessige seksjoner, det er beta-sheet-strukturer og alfa-helikser.

Vanligvis, i kuleproteiner, er de hydrofobe områdene av molekylet plassert dypt i molekylet. Ved å kombinere med hverandre dannes hydrofobe radikaler hydrofobe klynger(sentre). Dannelsen av en hydrofob klynge tvinger molekylet til å bøye seg i rommet tilsvarende. Vanligvis inneholder et kuleformet proteinmolekyl flere hydrofobe klynger dypt inne i molekylet. Dette er en manifestasjon av dualiteten av egenskapene til proteinmolekylet: på overflaten av molekylet er det hydrofile grupper, derfor er molekylet som helhet hydrofilt, og i dypet av molekylet er hydrofobe radikaler skjult.

KVARTERNÆR STRUKTUR

Det finnes ikke i alle proteiner, men bare i de som består av to eller flere polypeptidkjeder. Hver slik kjede kalles en SUBUNIT av et gitt molekyl (eller PROTOMER). Derfor kalles proteiner med en kvartær struktur OLIGOMERE proteiner. Et proteinmolekyl kan inneholde identiske eller forskjellige underenheter. For eksempel består hemoglobin "A" -molekylet av to underenheter av en type og to underenheter av en annen type, det vil si at det er en tetramer. De kvaternære strukturene til proteiner er fiksert av alle typer svake bindinger, og noen ganger også av disulfidbindinger.

Kvartær struktur finnes ikke i alle proteiner. Hver polypeptidkjede kalles en SUBUNIT av det molekylet (eller PROTOMER).

Derfor kalles proteiner med en kvartær struktur OLIGOMERE proteiner.

Et proteinmolekyl kan inneholde identiske eller forskjellige underenheter

Kooperativ samhandling

Når en ligand binder seg til en spesifikk region av et protein, skjer det en endring i strukturen til proteinmolekylet, som igjen påvirker aktiviteten til en annen, romlig fjern region (underenhet, domene).

Kooperative endringer

Konformasjonene til oligomere proteiner danner grunnlaget for mekanismen for å regulere den funksjonelle aktiviteten til ikke bare hemoglobin, men også mange andre proteiner.

Et protein kan endre konformasjonen ikke bare når det interagerer med en ligand, men også som et resultat av enhver kjemisk interaksjon. Et eksempel på en slik interaksjon er tilsetning av en fosforsyrerest (fosforylering).

3. Native proteinkonformasjon: funksjonell betydning, formasjonsmekanisme. Proteindenaturering. Folding. Chaperones og deres rolle i folding og renaturering. Sykdommer forbundet med foldeforstyrrelser.

NATIVITET (Natura (lat.) – natur) er et unikt kompleks av fysiske, fysisk-kjemiske, kjemiske og biologiske egenskaper til et proteinmolekyl, som tilhører det når proteinmolekylet er i sin naturlige, naturlige (native) tilstand.

For å betegne prosessen der de native egenskapene til et protein går tapt, brukes begrepet DENATURING.

DENATURING - dette er fratakelse av et protein av dets naturlige, native egenskaper, ledsaget av ødeleggelse av den kvartære (hvis det var en), tertiær, og noen ganger sekundær struktur av proteinmolekylet, som oppstår når disulfid og svake typer bindinger er involvert. i dannelsen av disse strukturene blir ødelagt.

Den primære strukturen er bevart fordi den er dannet av sterke kovalente bindinger.

Ødeleggelse av primærstrukturen kan bare skje som et resultat av hydrolyse av proteinmolekylet ved langvarig koking i en syre- eller alkaliløsning.

FAKTORER SOM FØRER DENATUERING AV PROTEIN

kan deles inn i fysisk Og kjemisk.

Fysiske faktorer

Høye temperaturer

Ultrafiolett bestråling

Røntgen og radioaktiv eksponering

Ultralyd

Mekanisk påvirkning (for eksempel vibrasjon).

Kjemiske faktorer

Konsentrerte syrer og alkalier. For eksempel trikloreddiksyre (organisk), salpetersyre (uorganisk).

Tungmetallsalter

Organiske løsemidler (etylalkohol, aceton)

Plante alkaloider

Andre stoffer som kan bryte svake typer bindinger i proteinmolekyler.

Eksponering for denatureringsfaktorer brukes til å sterilisere utstyr og instrumenter, samt som antiseptika.

Reversibilitet av denaturering

in vitro er denaturering oftest irreversibel

In vivo, i kroppen, er rask renaturering mulig. Dette skyldes produksjonen av spesifikke proteiner i en levende organisme som "gjenkjenner" strukturen til det denaturerte proteinet, fester seg til det ved hjelp av svake typer bindinger og skaper optimale forhold for renaturering.

Slike spesifikke proteiner er kjent som "varmesjokkproteiner", "stressproteiner" eller chaperones.

Under ulike typer stress induseres syntesen av følgende proteiner:

når kroppen overopphetes (40-440C),

for virussykdommer,

for forgiftning med salter av tungmetaller, etanol etc. Reversibilitet av denaturering

I et reagensrør (in vitro) er dette oftest en irreversibel prosess. Hvis et denaturert protein plasseres under forhold som er nært de opprinnelige, kan det renatureres, men veldig sakte, og dette fenomenet er ikke typisk for alle proteiner.

Stressproteiner

Det er flere familier av disse proteinene, de er forskjellige i molekylvekt.

For eksempel er proteinet hsp 70, et varmesjokkprotein med en masse på 70 kDa, kjent.

Slike proteiner finnes i alle celler i kroppen. De utfører også funksjonen til å transportere polypeptidkjeder gjennom biologiske membraner og deltar i dannelsen av de tertiære og kvaternære strukturene til proteinmolekyler. De listede funksjonene til stressproteiner kalles chaperone-funksjoner. Under ulike typer stress induseres syntesen av slike proteiner: når kroppen overopphetes (40-44 0 C), under virussykdommer, forgiftning med salter av tungmetaller, etanol, etc.

Et økt innhold av stressproteiner ble funnet i kroppen til sørlige folk sammenlignet med den nordlige rasen.

Varmesjokkproteinmolekylet består av to kompakte kuler forbundet med en løs kjede:

Ulike varmesjokkproteiner har en felles byggeplan. De inneholder alle kontaktdomener.

Ulike proteiner med forskjellige funksjoner kan inneholde de samme domenene. For eksempel har ulike kalsiumbindende proteiner samme domene for dem alle, som er ansvarlig for binding av Ca+2.

Domenestrukturens rolle er at den gir proteinet større muligheter til å utføre sin funksjon på grunn av bevegelsene til ett domene i forhold til et annet. Områdene der to domener går sammen er de strukturelt svakeste stedene i molekylet til slike proteiner. Det er her bindingshydrolyse oftest skjer og proteinet blir ødelagt.

Varmesjokkproteinmolekylet består av to kompakte kuler forbundet med en løs kjede.

Også, med deltakelse av chaperoner, skjer proteinfolding under syntesen, noe som gir proteinet muligheten til å adoptere sin opprinnelige struktur.

Sykdommer assosiert med proteinfoldingsforstyrrelser.

Amyloidose er avsetning av amyloid i vev.

Amyloid er fibrillære avleiringer av proteiner som er dårlig løselig i vann (konformasjonsforstyrrelse).

Konseptet med prioner

Proteiner som har smittsomme egenskaper (enten kommer inn i kroppen eller dannes spontant)

Det er en normal analog av dette proteinet i menneskekroppen (primærstrukturen er identisk)

Sekundær struktur er forstyrret

Prioner er resistente mot proteaser

Prioner danner aggregater som normale proteiner fester seg til, og endrer deretter deres sekundære struktur

Antagelig utvikler sykdommer som kuru og kugalskap seg på denne måten.

4. Fysisk-kjemiske egenskaper til proteiner. Proteiner liker hydrofile forbindelser. Årsaker til hydrofilisiteten til proteinmolekyler. Faktorer som påvirker ladningen og hydreringsskallet til proteiner (pH-verdi, tilstedeværelse av elektrolytter i løsning).

FYSISKE OG KJEMISKE EGENSKAPER TIL PROTEINER. PROTEINLØSELIGHET I VANN.

De fleste proteiner er hydrofile. Proteinmolekyler er imidlertid veldig store, så proteiner kan ikke danne ekte løsninger, men bare kolloidale. Den ytre manifestasjonen av dette er Tyndall-effekten (eller Tyndall-kjeglen). Tyndall-effekten er forårsaket av spredning av en tynn lysstråle når den passerer gjennom en proteinløsning. Til tross for deres store størrelse, utfelles ikke mange proteinmolekyler i vandige løsninger. Utfelling av proteinmolekyler forhindres stabiliseringsfaktorer for proteinløsning.

FAKTORER FOR PROTEINSTABILISERING I LØSNING.

HYDRATE SHELL er et lag med vannmolekyler orientert på en bestemt måte på overflaten av et proteinmolekyl. Overflaten til de fleste proteinmolekyler er negativt ladet, og dipolene til vannmolekyler tiltrekkes av de positivt ladede polene deres (se figur).

Jo flere hydrofile egenskaper et proteinmolekyl har, jo flere aminosyrer med polare (hydrofile) radikaler i sammensetningen og på overflaten, jo mer uttalt og mer fast holdt hydreringsskallet og jo flere lag inneholder det. Vannet i hydreringsskallet har spesielle egenskaper: det er ikke fritt, men er bundet til et proteinmolekyl. Dette er "bundet" vann. Det tilhører protein og har derfor spesielle egenskaper.

Egenskaper til vannhydreringsskall

a) Kokepunktet er over 100 0 C.

b) Frysetemperatur under 0 O C.

c) Ulike salter og andre hydrofile stoffer løses ikke opp i vannet i hydreringsskallet.

d) Omkring hvert proteinmolekyl hindrer hydreringsskallet disse proteinmolekylene i å nærme seg, kombineres og utfelles.

2) LADNING AV PROTEINMOLEKYLET. Overflaten til de fleste proteinmolekyler er ladet fordi hvert proteinmolekyl inneholder gratis ladede COO - og NH 3 + grupper. Det isoelektriske punktet (IEP) til de fleste kroppsproteiner er i et litt surt miljø. Dette betyr at slike proteiner har flere sure (COOH) grupper enn antall basiske grupper (NH 3). pH i blodplasma er omtrent 7,36 - dette er høyere enn IET for de fleste proteiner, så proteiner i blodplasma har en negativ ladning.

molekyler, forholdet mellom polare og ikke-polare grupper på overflaten av det native proteinmolekylet, løseligheten til proteiner og graden av resistens mot denaturerende midler.

/. Forskjeller i proteiner basert på molekylform

Som nevnt ovenfor, basert på formen på molekylene deres, er proteiner delt inn i kuleformede og fibrillære. Kuleproteiner har en mer kompakt struktur, deres hydrofobe radikaler er for det meste skjult i den hydrofobe kjernen, og de er mye mer løselige i kroppsvæsker enn fibrillære proteiner (med unntak av membranproteiner).

2. Forskjeller i proteiner etter molekylvekt

Proteiner er høymolekylære forbindelser, men kan variere mye i molekylvekt, som varierer fra 6000 til 1.000.000 D og høyere. Molekylvekten til et protein avhenger av antall aminosyrerester i polypeptidkjeden, og for oligomere proteiner, av antall protomerer (eller underenheter) inkludert i den.

3. Total ladning av proteiner

Proteiner inneholder radikaler av lysin, arginin, histidin, glutaminsyre og asparaginsyrer som inneholder funksjonelle grupper som er i stand til ionisering (ionogene grupper). I tillegg, ved N- og C-termini av polypeptidkjeder er det o-amino- og a-karboksylgrupper, som også er i stand til ionisering. Den totale ladningen til et proteinmolekyl avhenger av forholdet mellom ioniserte anioniske radikaler Glu og Asp og kationiske radikaler Lys, Apr og His.

Graden av ionisering av de funksjonelle gruppene til disse radikalene avhenger av pH i mediet. Ved en løsnings pH på ca. 7 er alle ioniske grupper av proteinet i en ionisert tilstand. I et surt miljø fører en økning i konsentrasjonen av protoner (H*) til undertrykkelse av dissosiasjonen av karboksylgrupper og en reduksjon i den negative ladningen til proteiner: -COO- + H* -> -COOH. I et alkalisk miljø fører bindingen av overflødig OH" med protoner dannet under dissosiasjonen av NH 3 * med dannelsen av vann til en reduksjon i den positive ladningen til proteiner: -NH/+OH-->-NH 2 + H 2 0.

pH-verdien ved hvilken proteinet får en total nullladning kalles det "isoelektriske punktet" og betegnes som det isoelektriske pH-punktet; antallet positivt og negativt ladede grupper av proteinet er det samme, dvs. at proteinet er i et isoelektrisk punkt. stat.

Siden de fleste proteinene i cellen inneholder mer anionisk gr(-COO~), ligger det isoelektriske punktet til disse tankene i et lett surt miljø. Det isoelektriske punktet til proteiner som inneholder kationiske grupper er funnet! i et alkalisk miljø. Det mest slående eksemplet på intracellulære proteiner som inneholder arginin og lysin. - histoner som er en del av kromatin.

Proteiner med en netto positiv eller negativ ladning er mer løselige enn proteiner lokalisert ved det isoelektriske punktet. Den totale ladningen øker antallet vanndipoler som er i stand til å binde seg til et proteinmolekyl og hindrer kontakten av lignende ladede molekyler. Som et resultat vil proteinløseligheten øke. Ladede proteiner kan bevege seg ■ elektrisk felt: anioniske proteiner, jeg har! De som har en negativ ladning vil bevege seg ■ til den positivt ladede anoden (+), og kationiske proteiner vil bevege seg til den negativt ladede katoden (-). Proteiner som er i en isoelektrisk tilstand beveger seg ikke i et elektrisk felt.

4. Forholdet mellom polare og ikke-polare grupper på overflaten av tverrbundne proteinmolekyler

Polare radikaler dominerer på overflaten av de fleste intracellulære proteiner, men forholdet mellom polare og ikke-polare grupper varierer for ulike individuelle proteiner. Således inneholder protomerer av oligomere proteiner i området for kontakt med hverandre ofte hydrofobe radikaler. Overflatene til proteiner som fungerer som en del av membraner eller festet til dem under funksjon, er også beriket med hydrofobe radikaler. Slike proteiner er mer løselige i lipider enn i vann.

Spørsmål 5. Metoder for separasjon og rensing av proteiner. Utsalting, dialyse, elektroforese, kromatografi. Grunnleggende metoder for kvantitativ bestemmelse av protein i løsninger (fotometri, immunkjemi).

Metoder for proteinisolering og rensing

Å skaffe individuelle proteiner fra biosyntetisk materiale (vev, organer, cellekulturer) krever sekvensielle operasjoner, inkludert:

Knusing av biologisk materiale og ødeleggelse av cellemembraner;

Fraksjonering av organeller som inneholder visse proteiner;

(■ ekstraksjon av proteiner (overføre dem til en oppløst tilstand);

Separering av en blanding av proteiner til individuelle proteiner.

Metoder for vevsdestruksjon og proteinekstraksjon

For å ødelegge biologisk materiale brukes metoder: vevshomogenisering, månedlig vekslende frysing og tining, samt ultralydbehandling av celler.

Homogenisering av biologisk materiale

Vevet, som ligger i en bufferløsning med en viss pH-verdi og saltkonsentrasjon, plasseres i et glasskar (homogenisator) med en støder. Den roterende støderen knuser Jeg gnir stoffet mot karets grunnvegger.

Metode for frysing og tining av vev

Som et resultat av vekselvis frysing og tining, ødelegger de resulterende iskrystallene cellemembranene.

Etter destruksjon av vevet utfelles de uløselige delene ved sentrifugering. Påfølgende sentrifugering av homogenatet ved forskjellige hastigheter gjør det mulig å oppnå separate fraksjoner som inneholder cellekjerner, mitokondrier og andre organeller, samt en supernatant som inneholder løselige proteiner fra cellecytosolen. Proteinet du leter etter vil være inneholdt i en av disse fraksjonene.

Ekstraksjon av membranassosierte proteiner og nedbrytning av oligomere proteiner til protomerer

Hvis det ønskede proteinet er tett bundet til noen cellestrukturer, må det overføres til løsning. For å ødelegge hydrofobe interaksjoner mellom membranproteiner og lipider tilsettes detergenter til løsningen; Triton X-100 eller natriumdodecylsulfat brukes oftest.

Virkningsmekanismen til vaskemidler er beskrevet i avsnittet "Denaturering av proteiner" (se fig. 1-15). Når de utsettes for vaskemidler, blir hydrofobe interaksjoner mellom protomerer i oligomere proteiner vanligvis ødelagt.

Fjerning av ikke-proteinstoffer fra løsningen

Nukleinsyrer, lipider og andre ikke-proteinstoffer kan fjernes fra løsningen ved å bruke deres spesielle fysisk-kjemiske egenskaper. Således fjernes lipider lett fra løsningen ved å tilsette organiske løsningsmidler, slik som aceton. Eksponering bør imidlertid være kortvarig, siden aceton forårsaker denaturering av noen proteiner. Nukleinsyrer utfelles ved å tilsette streptomycin til løsningen.

2. Proteinrensingsmetoder

Det mest arbeidskrevende stadiet for å oppnå individuelle proteiner er rensingen av dem fra andre proteiner som er tilstede i løsningen oppnådd fra et gitt vev. Ofte er proteinet som studeres til stede i små mengder, som representerer en brøkdel av en prosent av alle proteiner i løsningen.

Siden proteiner har konformasjonslabilitet, bør denaturerende effekter unngås når du arbeider med proteiner; derfor skjer isolering og rensing av proteiner ved lave temperaturer. I de første stadiene av proteinrensing er det tilrådelig å bruke metoder som tar hensyn til ethvert karakteristisk trekk ved et gitt protein, for eksempel termisk stabilitet eller stabilitet i sure løsninger. De første rensemetodene er nødvendige for å fjerne hoveddelen av ballastproteiner fra løsningen, som skiller seg betydelig fra det frigjorte proteinet i fysisk-kjemiske egenskaper. Deretter brukes flere og mer raffinerte metoder for proteinrensing.

Proteinrensing ved selektiv denaturering

De fleste proteiner denaturerer og utfelles selv når løsningen varmes opp kort til 50-70 °C eller løsningen surgjøres til pH 5. Hvis det isolerte proteinet tåler disse forholdene, er det ved selektiv denaturering mulig å fjerne det meste av de fremmede proteinene ved å filtrere ut de utfelte proteinene, eller utfelle dem ved sentrifugering.

" "Salter ut

En metode for å rense proteiner basert på forskjeller i deres løselighet ved forskjellige saltkonsentrasjoner i løsning. Salter av alkali- og jordalkalimetaller forårsaker reversibel utfelling av proteiner, d.v.s. etter at de er fjernet, gjenvinner proteinene evnen til å løse seg opp, samtidig som de opprettholder deres opprinnelige egenskaper.

Oftest brukes forskjellige konsentrasjoner av ammoniumsulfatsalter - (NH 4) 2 S0 4 - for å skille proteiner ved å salte ut. Jo høyere løseligheten til proteinet er, desto større konsentrasjon av salt kreves for å salte det ut.

Gelfiltrering eller molekylsiktmetode

For å skille proteiner brukes ofte kromatografiske metoder, basert på fordeling av stoffer mellom to faser, hvorav den ene er mobil og den andre immobile. Kromatografiske metoder er basert på ulike prinsipper: gelfiltrering, ionebytte, adsorpsjon, biologisk affinitet.

Metoden for å separere proteiner ved hjelp av gelfiltreringskromatografi er basert på at stoffer som er forskjellige i molekylvekt fordeler seg ulikt mellom den stasjonære og den mobile fasen. Krom. kolonnen er fylt med et granulat av et porøst stoff Halvsakkarider dannes i strukturen til polysakkaridet. bindinger og granuler dannes som vann og lavmolekylære stoffer lett passerer gjennom. Avhengig av forholdene kan det dannes granuler med forskjellige størrelser på "porer" Den stasjonære fasen er væsken inne i granulene, som lavmolekylære stoffer og proteiner med liten molekylvekt kan trenge inn i. Proteinblanding, påføring EN på en kromatografikolonne, utvasking (eluering) ved å føre løsningsmidlet gjennom kolonnen. De største molekylene beveger seg også sammen med løsningsmiddelfronten.

Mindre molekyler diffunderer i granulene og går inn i den stasjonære fasen for en tid, noe som fører til at bevegelsen blir forsinket. Størrelsen på porene bestemmer størrelsen på molekyler som er i stand til å trenge inn i granulene

Siden gelstrukturen til Sephadex lett dannes under trykk, begynte geler å bli erstattet med mer stive matriser (Sefactil, Toy-1 Operl), som er sfæriske granuler med forskjellige porestørrelser. Valg av porestørrelser! i granuler avhenger av formålet med kromatografi (andre kromatografiske metoder vil bli diskutert nedenfor).

Ultrasentrifugering

Separasjonsmetoden er også basert på forskjeller i molekylvekter til proteiner. Sedimenteringshastigheten av stoffer under rotasjon i en ultrasentrifuge, der sentrifugalakselerasjonen når 100 000-500 000 g, er proporsjonal med deres molekylvekt. Et tynt lag av en proteinblanding påføres overflaten av bufferløsningen plassert i en kyvette. Kyvetten plasseres i ultrasentrifugerotoren. Når rotoren roterer i 10-12 timer, legger større molekyler (med høyere molekylvekt) seg i bufferløsningen med en raskere hastighet. Som et resultat, i kyvetten, separeres proteinblandingen i separate fraksjoner med forskjellig molekylvekt (fig. 1-56). Etter separering av proteinfraksjonene stikkes bunnen av kyvetten gjennom med en nål og innholdet samles dråpe for dråpe i små porsjoner i reagensglass. «Elektroforese av proteiner

Metoden er basert på det faktum at når man bestemmer pH-verdien og ionestyrken til en hvit løsning,

ki beveger seg i et elektrisk felt med en hastighet proporsjonal med deres totale ladning. Proteiner med netto negativ ladning beveger seg mot anoden (+), og positivt ladede proteiner beveger seg mot katoden (-).

Elektroforese utføres på forskjellige medier: papir, stivelsesgel, polyakrylamidgel osv. I motsetning til elektroforese på papir, hvor hastigheten på proteinbevegelsen kun er proporsjonal med deres totale ladning, er hastigheten på proteinbevegelsen proporsjonal med deres totale ladning i en polyakrylamidgel. molekylære masser.

Oppløsningen av elektroforese i polyakrylamidgel er høyere enn på papir. Under elektroforese av humane blodserumproteiner påvises således kun 5 hovedfraksjoner på papir: albuminer, a-globuliner, c-globuliner, P-globuliner og γ-globuliner Elektroforese av de samme proteinene i en polyakrylamidgel gjør det mulig å få opptil 18 forskjellige fraksjoner. For å oppdage proteinfraksjoner behandles strimler av papir eller gelkolonner med et fargestoff (oftest bromfenolblått eller amidsvart). Det fargede komplekset av proteiner og fargestoff avslører plasseringen av forskjellige fraksjoner på bæreren.

Ionebyttekromatografi

Akkurat som elektroforese, er metoden basert på separasjon av proteiner som er forskjellige i total ladning ved visse pH-verdier og ionestyrke til løsningen. Når en proteinløsning føres gjennom en kromatografisk kolonne fylt med et fast porøst ladet materiale, holdes noen av proteinene tilbake på den som et resultat av elektrostatiske interaksjoner.

Som en stasjonær fase brukes ionebyttere - polymere organiske stoffer som inneholder ladede funksjonelle grupper.

Det er positivt ladede anionbyttere, blant hvilke de mest brukte er dietylaminoetylcellulose (DEAE-cellulose), som inneholder kationiske grupper, og negativt ladede kationbyttere, for eksempel karboksymetylcellulose (CM-cellulose), som inneholder anioniske grupper.

CH2-CH3

0-CH2-CH2-N4 "0-CH2-COO"

H CH2-CH3

Dietylamin etylcellulose Karboksymetylcellulose

Valget av ionebytter bestemmes av mengden protein som isoleres. Så, for utvalget av OTrish

For et tett ladet protein brukes en anionbytter. Når en proteinløsning føres gjennom en kolonne, avhenger styrken av bindingen av proteinet til anionbytteren av antall negativt ladede karboksylgrupper i molekylet. Proteiner adsorbert på en anionbytter. kan vaskes bort (elueres) med bufferløsninger med ulik saltkonsentrasjon, oftest NaCI, og ulik pH-verdi. Klorioner binder seg til positivt ladede funksjonelle grupper i anionbytteren og jeg fortrenger karboksylgruppene til proteiner. Ved lave saltkonsentrasjoner elueres proteiner som er svakt bundet til anionbytteren. En økning i saltkonsentrasjon ved sengetid eller en endring i pH, som endrer ladningen til proteinmolekylet, fører til frigjøring av proteinfraksjoner, hvorav en inneholder det ønskede proteinet. \/ Affinitetskromatografi, eller affinitetskromatografi

Dette er den mest spesifikke metoden for å isolere individuelle proteiner, basert på den selektive interaksjonen av proteiner med ligander festet (immobilisert) til en fast bærer. Et substrat eller koenzym kan brukes som en ligand hvis et enzym er isolert, antigener for isolering av antistoffer, etc. En løsning som inneholder en blanding av proteiner føres gjennom en kolonne fylt med en immobilisert ligand. Bare et protein som spesifikt interagerer med det er festet til liganden; alle andre proteiner kommer ut med eluatet (fig. 1-58). Protein adsorbert på kolonnen kan fjernes ved å vaske det med en løsning med endret pH-verdi eller endret ionestyrke. I noen tilfeller brukes en vaskemiddelløsning for å bryte de hydrofobe bindingene mellom proteinet og liganden.

Affinitetskromatografi er svært selektiv og hjelper til med å rense det isolerte proteinet tusenvis av ganger.

Funksjoner ved strukturen og funksjonen til kroppen avhenger av settet med proteiner som er syntetisert i den. Å studere strukturen og egenskapene til proteiner er umulig uten å isolere dem fra cellen og rense dem fra andre proteiner og organiske molekyler. Stadier av isolasjon og rensing av individuelle proteiner:

1 Celleødeleggelse vevet som studeres og oppnår et homogenat.

2 Separering av homogenatet i fraksjoner ved sentrifugering, oppnåelse av en kjernefysisk, mitokondriell, cytosolisk eller annen fraksjon som inneholder det ønskede proteinet.

3 Selektiv termisk denaturering- kortvarig oppvarming av en proteinløsning, hvor noen av de denaturerte proteinurenhetene kan fjernes (hvis proteinet er relativt varmestabilt).

4 Salting ut. Ulike proteiner utfelles ved forskjellige saltkonsentrasjoner i løsning. Ved gradvis å øke konsentrasjonen er det mulig å oppnå en rekke separate fraksjoner med et overveiende innhold av isolert protein i en av dem. Ammoniumsulfat brukes oftest til proteinfraksjonering. Proteiner med minst løselighet utfelles ved lave saltkonsentrasjoner.

5 Gelfiltrering- en metode for molekylær sikting av molekyler gjennom hovne Sephadex-granuler (tredimensjonale polysakkaridkjeder av dekstran med porer). Hastigheten for passasje av proteiner gjennom en kolonne fylt med Sephadex vil avhenge av deres molekylær vekt: jo mindre massen av molekyler er, desto lettere trenger de inn i granulene og jo lenger de blir der; jo større massen er, desto raskere eluerer de fra kolonnen.

6 Ultrasentrifugering- en metode som går ut på å plassere proteiner i et sentrifugerør inn i rotoren til en ultrasentrifuge. Når rotoren roterer, er sedimenteringshastigheten til proteiner proporsjonal med deres molekylvekt: tyngre proteiner danner fraksjoner som ligger nærmere bunnen av kyvetten, lettere - til overflaten.

7 Elektroforese- en metode basert på forskjeller i bevegelseshastigheten til proteiner i et elektrisk felt. Denne verdien er proporsjonal med ladningen til proteinene. Proteinelektroforese utføres på papir (hvor hastigheten på proteinbevegelsen bare er proporsjonal med ladningen deres) eller i en polyakrylamidgel med en viss porestørrelse (hastigheten på proteinbevegelsen er proporsjonal med ladningen og molekylvekten).

8 Ionebytterkromatografi- en fraksjoneringsmetode basert på binding av ioniserte grupper av proteiner med motsatt ladede grupper av ionebytteruløselige polymerer. Styrke av binding av protein til harpiks proporsjonal med ladningen til proteinet. Proteiner adsorbert på ionebytterpolymeren kan vaskes bort med økende konsentrasjoner av NaCl; Jo lavere proteinladning, desto lavere er konsentrasjonen av NaCl som kreves for å vaske bort proteinet festet til de ioniske gruppene i harpiksen.

9 Affinitetskromatografi- den mest spesifikke metoden for å isolere individuelle proteiner. En ligand av et protein er kovalent festet til en inert polymer. Når en proteinløsning føres gjennom en kolonne med en polymer, blir bare proteinet spesifikt for en gitt ligand adsorbert på kolonnen på grunn av den komplementære bindingen av proteinet til liganden.

10 For å fjerne lavmolekylære forbindelser fra en løsning av isolert protein, bruk dialyse. Metoden er basert på proteiners manglende evne til å passere gjennom en semipermeabel membran, som lett lar lavmolekylære stoffer, spesielt salter, passere gjennom. Det brukes til å rense proteiner fra lavmolekylære urenheter, for eksempel salter etter utsalting.

Oppgaver

1 Bestem den totale ladningen til pentapeptidet ved pH 7,0:

Glu-Arg-Liz-Val-Asp

Hvordan vil den totale ladningen til dette peptidet endre seg:

a) ved pH<7,0;

b) ved pH >7,0?

2 Bestem IET for peptider (>,< или =7,0):

a) Pro-Liz-Tir-Gln-Tre;

b) Ala-Ser-Glu-Asn-Met.

3 Sammenlign bevegelsesretningen i det elektriske feltet til to peptider ved pH 7,0 (mot katoden eller anoden):

a) Val-Glu-Ala;

b) Ley-Asn-Arg.

4 Sammenlign løseligheten til de to peptidene ved pH 7,0:

Ser-Cis-Glu-Tir-Asp;

Val-Arg-Meth-Fen-Tir.

5 Nukleære histonproteiner inneholder et stort antall aminosyrerester av arginin og lysin, og blodproteinet albumin inneholder mange glutamin- og asparaginsyrerester. Svar på spørsmålene:

a) i hvilke miljøer (>,< или =7,0) лежит ИЭТ этих белков?

b) hvilket av de to proteinene kan Ca 2+ samhandle med?

6 Match den nummererte metoden for separasjon og rensing av proteiner med deres tilsvarende egenskaper som denne metoden er basert på:

A) Forskjeller i ladningsstørrelse.

B) Forskjeller i molekylvekt.

D) Ingen.

1 Gelfiltrering.

2 Elektroforese i polyakrylamidgel.

3 Affinitetskromatografi.

4 Ionebytterkromatografi.

A) Ultrasentrifugering.

B) Gelfiltrering.

B) Elektroforese i polyakrylamidgel.

D) Ionebytterkromatografi.

D) Affinitetskromatografi.

1 Brukes til å skille protein fra salt.

2 Metoden er basert på binding av et protein til en immobilisert ligand.

3 Metoden er basert på bruk av forskjeller i molekylvekt og ladning av proteiner.

8 Velg metoder som kan brukes til å skille en blanding av proteiner til individuelle proteiner; angi de fysisk-kjemiske egenskapene til proteiner som ligger til grunn for hver metode.

9 Hvordan påvirker den totale ladningen til et protein dets løselighet:

a) Bestem den totale ladningen av peptidet ved pH 7,0

Ala-Glu-Tre-Pro-Asp-Liz-Cis;

b) hvordan vil ladningen til dette peptidet endre seg ved pH >7,0, pH<7,0, рН<<7,0?

c) hva er det isoelektriske punktet (IEP) til et protein og i hvilket miljø ligger IEP til et gitt peptid?

d) ved hvilken pH-verdi vil den minste løseligheten av dette peptidet bli observert?

10 Hvorfor stivner surmelk, i motsetning til fersk melk, når den kokes (dvs. melkeproteinet kasein faller ut)? I fersk melk har kaseinmolekyler en negativ ladning.

11 Løs problemet En blanding som inneholder proteinene A, B og C med molekylvekter på henholdsvis 160 000, 80 000 og 60 000 D ble analysert ved gelfiltrering. De hovne gelgranulene er permeable for proteiner med en mol. som veier mindre enn 70 000 D. Angi mulige alternativer for rekkefølgen for frigjøring av proteinene A, B og C fra kolonnen.

12 Sammenlign bruken av dialyse og gelfiltrering:

1 Metoden brukes til å rense proteiner fra forbindelser med lav molekylvekt.

2 Metoden brukes til fraksjonering av høymolekylære stoffer basert på forskjeller i molekylvekt.

3 Metoden brukes til å separere proteiner basert på deres totale ladning.

4 Metoden brukes til å bestemme molekylvekten.

A) Karakteristisk for dialyse.

B) Karakteristisk for gelfiltrering.

C) Karakteristisk for begge metodene.

D) Ukarakteristisk for noen av dem.

5.3 Sikkerhetsspørsmål

1 Hva bestemmer løseligheten til proteiner?

2 Beskriv trinnene i proteinisolering og rensing. Hva er lyofilisering?

3 Molekylmasse av proteiner og metoder for dens bestemmelse.

4 Amfotere egenskaper til proteiner. Isoelektrisk punkt.

Bibliografi

1 Biokjemi // utg. E.S.Severina, A.Ya.Nikolaeva. – M: GEOTAZ-MED. 2001. – 449 s.

2 Plastinina Z.A., Zhamsaranova S.D. Retningslinjer for egenforberedelse til laboratorietimer i biologisk kjemi. - Ulan-Ude: Publishing House of the All-Russian State Technical University, 2003. - 109 s.

3 Filippovich Yu.B. Biokjemi av protein og nukleinsyrer. - M.: Opplysning. 1978. - 203 s.

4 Anisimov A.A. og andre Grunnleggende om biokjemi. - M.: Høyere. skole, 1985. - 398 s.

5 Filippovich Yu.B., Egorova T.A., Sevastyanova G.A. Workshop om generell biokjemi. - M.: Utdanning, 1982. - 157 s.

6 Ostromov S.A. Introduksjon til biokjemisk økologi. - M.: Mir, 1986. -

7 Williams B., Wilson K. Metoder for praktisk biokjemi. - M.:Mir, 1978. - 268 s.